IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2017

При изучении такой учебной дисциплины, как паразитология, важной частью учебного процесса является ознакомление студентов с микропрепаратами. Однако зачастую кабинеты недостаточно оснащены ими, или их качество не позволяет получить четкие представления об изучаемых объектах. Достаточно часто можно заметить, что со временем препараты обесцвечиваются, а их длительное и не всегда бережное использование приводит к появлению трещин и сколов. В то же время, обновление и пополнение имеющегося ассортимента микропрепаратов за счет препаратов промышленного производства не всегда является возможным ввиду их дороговизны, а также элементарного отсутствия необходимого материала на рынке. В связи с этим мы решили самостоятельно испробовать различные методики изготовления микропрепаратов по паразитологии. Трудность заключается в том, что в свободном доступе информации по данной теме крайне мало. Именно поэтому мы решили опробовать существующие методики, и, по возможности, усовершенствовать их.

Цель нашей работы заключалась в освоении различных техник изготовления микропрепаратов. Для достижения поставленной цели нам было необходимо решить следующие задачи: изучить методы выявления яиц различных возбудителей из проб; подобрать условия для накопления и длительного хранения яиц; изготовить фиксированные неокрашенные/окрашенные микропрепараты; освоить технику заливки микропрепаратов глицерин-желатиной.

Выявления и накопление яиц различных возбудителей из проб фекалий [2]

В своей работе для выявления яиц гельминтов [1] мы проводили гельминтоовоскопию проб комбинированным методом Дарлинга. Накопление яиц гельминтов необходимо как для непосредственного изучения их студентами, так и последующего изготовления из них постоянных препаратов. Большим плюсом накопления яиц в глицерине является то, что яйца не изменяют своей структуры, что очень важно для корректного изучения материала. Для приготовления постоянных препаратов свежевыделенные яйца не пригодны. Они должны быть предварительно выдержаны в глицерине. Согласно данной методики, выделенные яйца помещают в 50% водный раствор глицерина, в котором выдерживают не менее 7—10 дней до приготовления препаратов. Сохранение их в глицерине более длительное время (месяцы и даже год) не отражается на структуре яиц. Однако в ней не указано максимальное количество глицерина, в которое должны быть помещены яйца, вследствие чего нами было последовательно проведено 2 опыта по накоплению паразитологического материала. В первом опыте, яйца аскаридий, выделенные из проб свиньи, вместе с поверхностной пленкой были помещены в пенициллиновый флакончик, заполненный 5 мл 50% глицерина. Впоследствии, автоматической пипеткой, из него было взято 3 пробы: с поверхности, из толщи и со дна. Единичное яйцо было обнаружено лишь в пробе со дна флакончика.

Для усовершенствования методики был проведен 2-й опыт. Была взята проба от свиньи, с повышенной концентрацией яиц власоглавов. Как и в прошлый раз, мы собрали поверхностную пленку, однако, на этот раз поместили ее во флакончик меньшего объема, в 1 мл 50% глицерина. В дальнейшем оттуда автоматической пипеткой было также взято 3 пробы: с поверхности со дна и из толщи глицерина после перемешивания слоев. Яйца, были найдены во всех трех пробах, однако их количество было наибольшим в пробе с поверхности, наименьшее же количество яиц наблюдалось в пробе со дна флакончика.

Изготовление постоянных неокрашенных препаратов из круглых червей рода Toxocara [2]

Препараты из взрослых особей токсокар были приготовлены 2 способами:

1) по методике изготовления постоянных неокрашенных фиксированных препаратов (Рис.1);

2) по методике изготовления постоянных фиксированных препаратов, заключенных в глицерин- желатину (Рис.1).

Для фиксации членики были расположены на предметном стекле и погружены в 70° спирт на 24 часа для фиксации. По окончании фиксации токсокар извлекают из спирта и осторожно снимают с поверхности стекол препаровальной иглой в 70% спирт. Затем производят обезвоживание в спиртах восходящей крепости, помещая материал из 70° в 80°, в 96° и еще раз в 96° спирт, выдерживая в каждом из них по 5 мин. После обезвоживания в спиртах препараты должны быть просветлены. С этой целью препараты последовательно проводят через карбол-ксилол, ксилол и еще раз ксилол. В указанных жидкостях препараты должны находиться не более одной минуты в каждой. Затем препараты заключают в канадский бальзам.

Для изготовления препаратов, заключенных в глицерин-желатину, гельминтов помещают в воду на 3 ч для промывания, затем их последовательно проводят через смеси спирта разной крепости и глицерина по следующей схеме:

1-я смесь —20 мл 40° спирта и 2 мл глицерина

2-я смесь—20 мл 50° спирта и 5 мл глицерина

3-я смесь —20 мл 60° спирта и 6 мл глицерина

4-я смесь— 20 мл 70° спирта и 10 мл глицерина

В каждой из указанных смесей гельминты выдерживаются по 24 часа. Сосуд с последней смесью через 24 часа приоткрывают для того, чтобы спирт испарился и откуда их извлекают по одному экземпляру на предметное стекло. На расправленный гельминт наносят расплавленную глицерин-желатину, осторожно накрывают покровным стеклом и слегка придавливают.

 

2

1

 

Рис.3. Toxocara. изготовленные по 1-й (1) и 2-й (2) методике.

Стоит отметить, что препараты, приготовленные проводкой через спирт позволяют подробно рассмотреть кутикулу паразита, в то время как у токсокар из спирт-глицерина хорошо просматривается содержимое.

Изготовление постоянных фиксированных и окрашенных препаратов [2]

Согласно данной методике нами были изготовлены препараты члеников Dipylidium caninum (Рис.2). Членики выдерживают в воде 12 ч, после чего их раскладывают на предметном стекле, накрывают его другим. Препараты переносят в 70° спирт на 12 ч. По окончании фиксации гельминты осторожно снимают со стекол и погружают в солянокислый кармин на 1 ч, после чего, для удаления излишков краски и выявления деталей строения членики переносят в солянокислый спирт на 10 мин. После того как станут хорошо заметными семенники, яичники и другие детали строения, препараты переносят в чистый 80° спирт.

С целью дальнейшего обезвоживания исследуемые объекты переносят в 96° спирт, дважды меняя порции. В бюксах со спиртами гельминты должны находиться не менее 5—7 мин. После этого объекты проводятся через карбол-ксилол и дважды через ксилол (в каждой жидкости не более 1-2 мин.). По окончанию проводки членики заключают в Канадский бальзам.

Рис.2. Окрашенный препарат членика Dipylidium caninum.

Данный метод позволяет увидеть на препарате такие детали строения, как семяпроводы, семенники и яичники.

Заключение

В заключение хочется сказать, что все освоенные нами методики изготовления паразитологических препаратов позволяют получить качественные препараты, дающие необходимую информацию об изучаемом объекте. Стоит отметить, что изготовление постоянных неокрашенных препаратов с последующей проводкой и фиксацией их в Канадский бальзам позволяют увидеть такие структуры гельминта, как кутикула, спикулы у самцов и «губки» у самок, в то время как проводка и последующая фиксация в глицерин- желатине позволяет подробно рассмотреть их содержимое (петли кишечника, матка с яйцами у самок и др). При накоплении яиц гельминтов, необходимо брать пробы фекалий, с высокой степенью инвазии, и сохранять их в небольшом объеме глицерина (до 1 мл).

Список литературы

1.Черепанов А.А. Атлас «Дифференциальная диагностика гельминтозов по морфологической структуре яиц и личинок возбудителей»/А.А.Черепанов.- М.: Колос, 2001.- 76 с.

2.http://parazity.net/study/2014/02/prigotovlenie-postoyannyx-preparatov-iz-vzroslyx-gelmintov-ix-fragmentov-i-yaic.html

Код для цитирования: Скопировать