IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2017

Одним из наиболее удобных модельных объектов биоиндикационных исследований являются земноводные (Леонтьева, Семенов, 1999). Бесхвостые амфибии, представляя связующее звено пресноводных водоемов и наземных экосистем, являются промежуточными, факультативными и дефинитивными хозяевами большого количества паразитов, а их гельминтофауна – составной частью водных экосистем. Формируя особый структурный уровень – паразитарные сообщества амфибий используются как биоиндикаторы состояния биоценозов (Евланов и др., 2004; Жигилева, Буракова, 2005; Матвеева, 2009). Изучение паразитофауны амфибий имеет практическое значение, поскольку некоторые паразитарные комплексы могут создавать потенциальные риски зоонозных инвазий, таких как церкариоз и аляриоз (Беэр, 2007; Шималов, 2002).

В связи с этим, важно корректно определить видовой состав гельминтов, уточнить их систематическое положение и морфологические особенности. Анализ живых паразитов непосредственно при вскрытии животных не всегда позволяет достоверно установить вид гельминта. Для этих целей принято использовать постоянные препараты паразитов. Паразитологические коллекции позволяют создать эталонные образцы гельминтов, что в дальнейшем облегчает прижизненное определение видов. Кроме того, данные коллекции являются уникальными, особенно это важно при создании эталонных образцов региональных видов гельминтов. Такие коллекции имеют высокое образовательное значение и могут использоваться в высших учебных заведениях при обучении студентов по таким специальностям как «Биология» и «Экология», а также для целей научно-производственной и учебной практик.

В связи с этим, целью нашей работы является ознакомление и отработка методики по изготовлению постоянных паразитологических препаратов и создание эталонных образцов региональной фауны гельминтов.

Объектом нашего исследования являются трематоды собранные от четырех видов бесхвостых амфибий: озерной лягушки (Pelophylax ridibundus Pallas, 1771), сибирской лягушки (Rana amurensis Boulenger, 1886), травяной лягушки (Rana temporaria Linnaeus, 1758) и остромордой лягушки (Rana arvalis Nilsson, 1842). Изготовление постоянных препаратов проводилось по стандартным методикам (Аниканова и др., 2007; Чернышева и др., 2009) с небольшими модификациями.

Обнаруженных паразитов фиксировали в 70° спирте, этикетировали и сохраняли для дальнейшей камеральной обработки, с целью определения видовой принадлежности гельминтов, для чего необходимо приготовить препарат. Для этого фиксированных в 70º спирте гельминтов промывали несколько часов (≈ 2 часа в зависимости от толщины гельминта) в проточной или часто сменяемой воде, затем помещали в краску. Трематод окрашивали квасцовым кармином. Для приготовления квасцового кармина необходимо 5 г алюмовокалиевых квасцов растворенных в 100 мл дистиллированной воды, затем прибавляли 2 г мелкорастёртого кармина и кипятили в течение 1 часа. Затем краситель остужали и фильтровали, добавляли в полученный раствор кристалл тимола для предохранения от плесени. Окрашивание производилось от 40 минут и более. Окрашенных паразитов (они должны быть интенсивно-малинового цвета) промывали в дистиллированной воде несколько минут и далее переносили в подкисленный спирт (на 100 мл 70º этилового спирта 1 мл концентрированной соляной кислоты) на 2-3 минуты для дифференцировки, проверяя интенсивность окрашивания под бинокулярным микроскопом MEIJI TECHNO EMZ-8TR (Япония). При дифференцировке покровы становятся светло-розовыми, иногда прозрачными, и на их фоне четко просматриваются органы и протоки. Излишки жидкости убирали фильтровальной бумагой. После чего, паразитов проводили через спирты возрастающей крепости (70º, 80º, 96º), выдерживая в них по несколько минут (1-2 минуты). Обезвоженных гельминтов просветляли гвоздичным маслом (или ксилолом) и заключали в кедровый (канадский) бальзам. Постоянные паразитологические препараты, в которых ещё не затвердел бальзам, нужно хранить в горизонтальном положении в специальных шкафах, предохраняющих их от пыли. Далее препарат этикетировали: на одном из концов предметного стекла записывали номер и вид амфибии на латыни, место локализации паразита в организме хозяина, указывали место и дату сбора проб, фамилию автора определившего вид гельминта. Надпись наносили на предметное стекло маркером «CD-fine liner 0,1».

В результате работы было изготовлено 35 препаратов, что позволило нам изучить внутреннее строение паразитов, поскольку морфология трематод является важным систематическим признаком. Уточнить принадлежность ряда представителей семейства Gorgoderidae Looss, 1901 к родам Gorgodera Looss, 1899 и Gorgoderina (Looss, 1902), а так же видовую принадлежность и стадии развития (метацеркария или марита) ряда паразитов. Так, трематода Codonocephalus urnigerus (Rudolphi 1819) mtc., локализующаяся в полости R. amurensis паразитировала на стации метацеркарии. Остальные виды трематод были половозрелыми (стадия мариты). Изготовлены постоянные препараты гельминтов ранее уже идентифицированных до вида: Haplometra cylindracea (Zeder, 1800), Pleurogenes intermedius Issaitchikow 1926, Pleurogenoides stromi (Travasos 1930), Pleurogenes claviger (Rudolphi, 1819), Prosotocus confusus (Looss 1894), Dolichosaccus rastellus (Olsson 1876), Pleurogenoides medians (Olsson 1876), Pneumonoeces variegatus (Rudolphi 1819), Opisthioglyphe ranae (Frölich 1791).

Для улучшения качества постоянных препаратов нами было использовано ряд модификаций стандартной методики. В зависимости от толщины и размеров гельминтов промывка в проточной воде составляла от 2 часов и более, а их окрашивание по времени – ½ от первого этапа (этап отмывки паразитов от фиксатора). Длительность промывания гельминтов от фиксатора является важным шагом в процессе изготовления препарата, влияющим на качество окрашивания.

Таким образом, освоение стандартных методов изготовления постоянных препаратов предоставило возможность наглядно изучить строение различных видов гельминтов, модификация методики позволила улучшить качество изготовленного материала и как следствие создать эталонную коллекцию региональных видов паразитов. Создание паразитологических образцов делает исследование более полным и имеет важное практическое значение, особенно при обнаружении патогенных видов гельминтов. Сбор паразитов амфибий и их детальное изучение позволяет учащимся образовательных учреждений получить наиболее полные сведения о различных систематических группах беспозвоночных животных, их систематике и морфологии.

Работа выполнена на базе Института экологии растений и животных УрО РАН в лаборатории функциональной экологии наземных животных. Авторы выражают благодарность д.б.н Вершинину В.Л. за возможность использования материала и оборудования.

Список использованной литературы:

1. Аниканова В.С., Бугмырин С.В., Иешко Е.П. Методы сбора и изучения гельминтов мелких млекопитающих. Учебное пособие. – Петрозаводск: Карельский научный центр Ран, 2007. – 145 с.

2. Беэр С.А., Воронин М.В. Церкариозы в урбанизированных экосистемах – M.: Наука, 2007. – 240 с.

3. Евланов И.А. Кириллов А.А., Чихляев И.В., Кириллова Н.Ю., Рубанова М.В., Трубицына О.В. Итоги и перспективы изучения паразитов позвоночных животных Самарской области // Основные достижения и перспективы развития паразитологии. – М., 2004. – С. 98-99.

4. Жигилева О.Н., Буракова А.В. Показатели стабильности развития и генетической изменчивости остромордой лягушки на урбанизированных и фоновых территориях // Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных: тез. докл. междунар. науч. конф. – Саранск, 2005. – С. 65-67.

5. Леонтьева О.А., Семенов Д.В. Земноводные как биоиндикаторы антропогенных изменений среды // Успехи соврем. биологии. – 1997. – Т. 117, № 6. – С. 726-737.

6. Матвеева Е.А. Эколого-фаунистические особенности гельминтофауны Rana ridibunda Pall. на территории Ульяновской области: автореф. дис. ...канд. биол. наук. – Ульяновск, 2009. – 24 с.

7. Чернышёва Н.Б., Кузнецова Е.В., Воронин В.Н., Ю.А. Стрелков. Паразитологическое исследование рыб. Методическое пособие. С.-П.: ГОСНИОРХ, 2009. 20 с.

8. Шималов В.В. Гельминтофауна земноводных открытых каналов в мелиорированных районах Белорусского Полесья // Паразитология. – 2002. –T. 36, № 4. – С. 304–309