IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2017

Введение

Начнем с того, как выглядит молекула ДНК. Молекулы полимеров характеризуются первичной структурой, под которой понимается просто состав молекулы (в данном случае – последовательность букв A, C, G и T, которые и составляют геном), вторичной структурой, т.е. тем, какие именно химические связи устанавливаются между этими компонентами и какие в результате получаются базовые пространственные структуры (в данном случае – двойная спираль), и третичной структурой, т.е. тем, как вторичная структура «уложена» в пространстве. Вторичная структура ДНК представляет собой двойную спираль, состоящую из четырёх разных нуклеотидов. Нуклеотиды обозначаются по содержащимся в них азотистым основаниям: аденину (A), цитозину (C), гуанину (G) и тимину (T) (есть ещё урацил, который в РНК заменяет тимин), и в дальнейшем мы всегда будем пользоваться этими буквами. В двойной спирали эти аминокислоты связаны друг с другом водородными связями, и связь устанавливается по принципу комплементарности: если в одной нити ДНК стоит A, то в комплементарной нити будет T, а если в одной нити C, то в другой будет G. Именно это позволяет относительно просто проводить репликацию (копирование) ДНК, например, при делении клетки: для этого достаточно просто разорвать водородные связи, разделив двойную спираль на нити, после чего парная нить для каждого «потомка» автоматически соберётся правильно.

Секвенирование ДНК - определение аминокислотной или нуклеотидной последовательности ДНК. В результате секвенирования получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. Размеры секвенируемых участков ДНК обычно не превышают 100 пар нуклеотидов и 1000 пар нуклеотидов при секвенировании по Сенгеру. В результате секвенирования перекрывающихся участков ДНК, получают последовательности участков генов, целых генов, тотальной мРНК и даже полных геномов организмов. [1]

1. ТРАДИЦИОННЫЕ МЕТОДЫ СЕКВЕНИРОВАНИЯ

1.1. Метод Эдмана.

Метод Эдмана — один из ранних методов секвенирования. Разработан в 1950—1956 годах шведским биохимиком Пэром Виктором Эдманом. Суть метода заключается в обработке исследуемого пептида определенным набором реагентов, что приводит к отщеплению одной аминокислоты с N-конца последовательности. Циклическое повторение реакции и анализ продуктов реакций дают информацию о последовательности аминокислот в пептиде. Метод Эдмана был широко распространен во второй половине ХХ века. В настоящее время практически не применяется из-за многих присущих ему недостатков (неколичественное протекание реакции, множественные побочные процессы).

ФИТЦ (фенилизотиоцианат)— реагент используемый для определения N-концевой аминокислоты в пептиде. Он способен реагировать с альфа-аминокислотами и альфа-карбоксильной группой свободных аминокислот. В результате взаимодействия с N-концевой аминокислотой полипептида образуется фенилтиогидантионовое производное, в котором дестабилизирована связь между альфа-карбоксильной группой N-концевой аминокислоты в пептиде. Эта связь избирательно гидролизуется без повреждения других пептидных связей. после реакции выделяют комплекс ФИТЦ с N-концевой аминокислотой, и идентифицируют его хроматографическим методом. Далее этот процесс повторяют с укороченным пептидом. Таким образом получают последовательность аминокислот в пептиде.[2]

1.2. Метод Сэнгера.

Дидезоксинуклеотидный метод, или метод «обрыва цепи», был разработан Ф. Сенгером в 1977 году и в настоящее время широко используется для определения нуклеотидной последовательности ДНК. При секвенировании по Сенгеру происходит гибридизация синтетического олигонуклеотида длиной 17—20 звеньев со специфическим участком одной из цепей секвенируемого участка. Этот олигонуклеотид является праймером, поставляющим 3'-гидроксильную группу для инициации синтеза цепи, комплементарной матрице.

Раствор с праймером распределяют по четырём пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида, dATP, dCTP, dGTP и dTTP (один из них — меченный радиоактивным изотопом) и один из четырёх 2',3'-дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddTTP, ddGTP или ddCTP). Дидезоксинуклеотид включается по всем позициям в смеси растущих цепей, и после его присоединения рост цепи сразу останавливается.

В результате этого в каждой из четырёх пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины, включающих праймерную последовательность. Далее в пробирки добавляют формамид для расхождения цепей и проводятэлектрофорез в полиакриламидном геле на четырёх дорожках. Проводят радиоавтографию, которая позволяет «прочесть» нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК.

В более современном варианте дидезоксинуклеотиды метят четырьмя разными флуоресцентными красителями и проводят ПЦР в одной пробирке. Затем во время электрофореза в полиакриламидном геле луч лазера в определённом месте геля возбуждает флуоресценцию красителей, и детектор определяет, какой нуклеотид в настоящий момент мигрирует через гель. Современные приборы используют для секвенирования ДНК капиллярный электрофорез.

2. МЕТОДЫ СЕКВЕНИРОВАНИЯ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ

2.1. Пиросеквенирование

Пиросеквенирование — это метод секвенирования ДНК (определение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК), основанный на принципе «секвенирование путём синтеза». При включении нуклеотида происходит детекция высвобождающихся пирофосфатов. Технология была разработана Полом Ниреном и его студентом Мустафой Ронаги, в Королевском Техническом Институте (Стокгольм) в 1996 году. [3]

Принцип метода довольно прост и основан на (+/-)-секвенировании, предложенном ещё в 60-х годах. При последовательном добавлении к ДНК-полимеразному комплексу дезоксинуклеозидтрифосфатов их включение в синтезируемую нить зависит от нуклеотидной последовательности матрицы. Полимеразный синтез ДНК сопровождается выделением пирофосфата. Этот пирофосфат в присутствии сульфурилазы и аденозинфосфосульфата преобразуется в АТФ и запускает окисление люциферина люциферазой, сопровождающееся биолюминесценцией. Люминесценция регистрируется фотоумножителем или цифровой камерой.

Приборное оснащение, необходимое для проведения пиросеквенирования, на первых порах не отличалось особой сложностью. В первоначальном варианте, описанном Hyman, предлагалось использовать проточный капилляр, содержащий несколько иммобилизованных ферментов и анализируемую ДНК. Корпорация "Biotage AB" (Швеция) предлагает приборы для работы с 96-луночными планшетами. Реагенты вводятся в лунки головкой струйного принтера, после чего не удаляются, а расщепляются специальным ферментом — апиразой.

Существенной особенностью более сложной технологии, разработанной компанией "454 Life Sciences", является использование эмульсионной ПЦР для одновременной параллельной подготовки сотен тысяч препаратов ДНК к секвенированию.

Такая пробоподготовка состоит из следующих этапов:

• Ультразвуковая фрагментация (небулизация) анализируемой ДНК;

• Пришивка адапторов и денатурация ДНК;

• Получение эмульсии, содержащей в микрокаплях единичные фрагменты ДНК и полистирольные шарики с пришитым праймером;

• Проведение эмульсионной ПЦР (emPCR);

• Отмывка микрошариков от реагентов и удаление несвязянных с шариками нитей ДНК;

• Загрузка шариков в лунки проточной камеры;

• Загрузка лунок микрошариками с иммобилизованными ферментами.

Пиросеквенатор "454 Life Sciences" состоит из комплекта бутылей с реагентами, управляемого компьютером многоканального насоса, проточной ячейки и чувствительной цифровой фотокамеры.

При пропускании реагентов через проточную ячейку регистрируются люминесцентные сигналы, излучаемые сотнями тысяч микролунок. На димерных, тримерных и тетрамерных нуклеотидных повторах интенсивность сигналов пропорционально увеличивается. В то же время надёжно дифференцировать гомогенные тетрамеры и пентамеры уже практически невозможно, что затрудняет секвенирование последовательностей с протяжёнными нуклеотидными повторами.

Протяжённость секвенируемых участков ДНК может превышать 100 оснований.

Недостатки данной технологии: в ранних экспериментах дАТФ давал высокое фоновое свечение. Причиной могли быть или примеси АТФ, или недостаточно высокая специфичность люциферазы. Для решения этой проблемы было предложено заменить дАТФ её аналогом с фосфотиоатной группой в альфа-положении (dATPS) или Sp-стереоизомером этого фосфотиоата.

Ещё одна проблема – большой расход растворов, пропускаемых через проточную ячейку. Все они содержат аденозинфосфосульфат, люциферин и особо чистые dNTP, один из которых к тому же химически модифицирован (dATP S). Высокие требования к чистоте dNTP обусловлены ещё и тем, что в их растворах из-за спонтанного гидролиза высокоэнергетических связей может накапливаться пирофосфат. Поэтому уже в самой первой работе, посвящённой пиросеквенированию, предлагалось пропускать растворы через микроколонку с иммобилизованной пирофосфатазой.

Лабильность и повышенные требования к чистоте препаратов dNTP могут служить серьёзными препятствиями для широкого применения пиросеквенирования. Кроме того, если выбрасывать все растворы после их прокачивания через проточную ячейку, то стоимость такого секвенирования будет непомерно высока. Отсюда можно сделать вывод о необходимости дополнительной очистки коммерческих препаратов непосредственно перед их использованием и об обязательной реутилизации всех отработанных растворов.

Таким образом, в настоящий момент существуют некоторые ограничения в применения данного способа секвенирования. Лимитирующим фактором является длина последовательности нуклеотидов, которая составляет около 300—500 нуклеотидов, что короче, чем 800—1000 нуклеотидов, достижимые методом обрыва цепи (например, метод Сэнгера). Такие ограничения могут затруднять секвенирование геномов, в частности, богатых повторенными последовательностями нуклеотидов. К 2007 году, пиросеквенирование обычно использовали для повторного секвенирования или секвенирования геномов, для которых известна последовательность нуклеотидов родственного вида. [4]

2.2. Метод Illumina/Solexa

Это метод секвенирования нового поколения, разработанный компанией Solexa.

В основе метода лежит принцип секвенирования путём синтеза:

• Одноцепочечные фрагменты ДНК закрепляются на твердой подложке.

• ДНК-зависимая ДНК полимераза синтезирует комплементарную цепь.

• Встраивание каждого нового нуклеотида регистрируется с помощью камеры.

В методе Solexa используются 3'- модифицированные нуклеотиды с присоединенными флюоресцентными метками разных цветов. Модификация нуклеотидов не позволяет ДНК-полимеразе присоединить больше одного нуклеотида. Флюоресценция инициируется коротким импульсом лазера и тип присоединенного нуклеотида определяется по цвету флюоресцентной метки. Модификация нуклеотида блокируется (полимераза теперь может двигаться дальше) и цикл повторяется снова. В результате удается определить последовательность ДНК длиной до 250 нуклеотидов. Такую последовательность ДНК называют прочтением или ридом — (калька с английского).

Первый секвенатор Genome Analyzer 1G был представлен компанией Solexa в 2006 году. Длина прочтения составляла 30-35 нуклеотида, можно было получить около 1 Gb информации. HiSeq 2000 (2011 год) способен секвенировать 6 человеческих геномов за 11 дней. Длина прочтения составляет 100 нуклеотидов, можно получить 600 Gb информации.

Принцип метода:

1. Подготовка ДНК. Исследуемая двуцепочечная ДНК фрагментируется. К двуцепочечным фрагментам с помощью ДНК-лигазы пришивается небольшой ДНК-фрагмент — адаптер. Адаптер состоит из двух олигонуклеотидов, частично комплементарных друг другу. При смешении таких олигонуклеотидов образуется «вилка», «ножка» которой состоит из двуцепочечной ДНК (там где олигонуклеотиды комплементарны), две «ручки» состоят из одноцепочечной ДНК. Лигаза пришивает два адаптера за «ножку» к каждому концу исследуемого фрагмента ДНК.

2. Далее происходит амплификация полученных фрагментов ДНК с помощью ПЦР. В результате образуется множество фрагментов двуцепочечной ДНК, на одном конце — первый олигонуклеотид, составляющий адаптер, на другом конце — второй.

• Подготовка ячейки (flowcell).

Ячейка содержит внутри 8 дорожек. В каждой дорожке может секвенироваться отдельный образец. На поверхность каждой дорожки пришиваются одноцепочечные олигонуклеотиды. Такие же, что использовались при создании адаптера. Эти олигонуклеотиды в будущем будут связывать исследуемую ДНК (так как они комплементарны адаптеру) и служить праймерами для мостиковой амплификации. В одном из олигонуклеотидов есть сайт для рестриктазы.

• Мостиковая амплификация.

Производится плавление исследуемой ДНК и уже одноцепочечные её фрагменты отжигаются на закрепленных на подложке праймерах.

1. В систему добавляется все необходимое для ПЦР, кроме праймеров. Праймеры уже есть — это иммобилизованные олигонуклеотиды.

2. Полимераза достраивает комплементарную цепь. Теперь каждый исследуемый фрагмент выглядит как двуцепочечная ДНК, конец одной из цепей пришит к поверхности ячейки.

3. Проводится плавление двуцепочечной ДНК, в результате которого комплементарные цепи ДНК расходятся. Цепь ДНК, которая не была закреплена на поверхности, удаляется. Каждый исследуемый фрагмент представляет собой одноцепочечную ДНК, пришитую к поверхности ячейки.

4. Своим незакрепленным концом цепь ДНК может образовать комплементарное взаимодействие со вторым иммобилизованным олигонуклеотидом. Теперь фрагмент расположен в виде «мостика» — один конец пришит к поверхности, другой держится за счет комплементарных взаимодействий.

5. Полимераза снова достраивает комплементарную цепь, используя в качестве праймера второй олигонуклеотид.

6. После плавления и удаления незакрепленных цепей ДНК фрагмент выглядит как две одноцепочечные ДНК, прикрепленные к поверхности. Одна цепь расположена «вверх ногами» относительно прикрепленной ДНК в пункте 1. Свободный конец каждой из цепей может образовать мостик с иммобилизованным олигонуклеотидом. Далее повторяются пункты 6 и 7.

7. После амплификации, вокруг каждого закрепленного фрагмента появляется большое количество его копий. Половина из копий расположена «вверх ногами». Добавляется рестриктаза, которая расщепляет один из прикрепленных олигонуклеотидов — ненужные копии вымываются. Теперь все копии ДНК, получившиеся в результате амплификации из начального фрагмента, расположены одинаково.

• Секвенирование.

1. ДНК-зависимая ДНК полимераза синтезирует комплементарную цепь. Встраивание каждого нового нуклеотида регистрируется с помощью камеры. В систему добавляются праймеры и ДНК-полимераза.

2. В систему добавляются 3′-O-азидометил 2′-деоксинуклеозид трифосфаты (A, C, G и T), каждый с отделяемой флюоресцентной меткой своего цвета. Наличие 3′-O-азидометила не позволяет ДНК-полимеразе присоединить больше одного нуклеотида. Полимераза присоединяет один модифицированный нуклеотид, оставшиеся нуклеотиды вымываются.

3. Ячейка освещается коротким импульсом лазера. Присоединенный флюорофор светится своим цветом. Так как после амплификации вокруг каждой молекулы ДНК есть множество её копий, свет множества одинаковых флюорофоров можно зарегистрировать.

4. В систему добавляется вещество (TCEP), из-за которого флюорофор и азидометил отделяются и вымываются. 3′-гидроксильная группа становится доступной для присоединения ещё одного нуклеотида.

5. Повторяются пункты 2-5.

Преимущества и недостатки метода:

По сравнению с другими методами секвенирования нового поколения, метод Illumina наиболее высокопроизводительный — 600 Gb за одно прочтение. Следовательно, стоимость секвенирования на 1 Gb информации будет небольшая. К положительным особенностям можно отнести и точность при небольшой длине прочтения.

Большинство возникающих ошибок секвенирования — неправильное определение присоединенного нуклеотида. Средняя частота ошибок составляет 0,5 % — одна ошибка на прочтение длиной 200 нуклеотидов. К недостаткам можно отнести высокую стоимость приборов и небольшую длину прочтений (до 250 нуклеотидов). [5]

Заключение

Одна из наиболее фундаментальных разработок, созданных для изучения генетики, секвенирование ДНК, позволяет ученым найти последовательность нуклеотидов в фрагментах ДНК.С этой технологией исследователи смогли изучать молекулярные последовательности, связанные со многими заболеваниями человека и многими другими проблемами.

Полное секвенирование генома в сочетании с применением методов генетической инженерии вносит свой вклад в во многие сферы научной деятельности.

Список литературы:

1. Геномика: постановка задачи и методы секвенирования [Электронный ресурс]

URL: http://www.vechnayamolodost.ru/articles/poplem/segdch13/

1. Метод Сэнгера [Электронный ресурс]

URL: https://ru.wikipedia.org/wiki/Метод_Сэнгера

1. Пиросеквенирование [Электронный ресурс]

URL: https://ru.wikipedia.org/wiki/Пиросеквенирование

1. Пиросеквенирование (аналитический обзор) [Электронный ресурс] URL: http://molbiol.ru/bio/001/001

2. Метод Illumina/Solexa [Электронный ресурс]

URL: https://ru.wikipedia.org/wiki/Метод_Illumina/Solexa

Код для цитирования: Скопировать