VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014

Поиск новых экологически чистых препаратов - альтернатив антибиотикам – это серьезная проблема для современной медицины и ветеринарии. Использование бактериофагов, обладающих лизирующим действием на конкретный возбудитель заболевания – это медицинская панацея в терапии. Бактериофаги экологически чисты, просты в применении и не имеют, отличие от антибиотиков, побочных эффектов [2].

Создание экологически чистого препарата точечного действия для лечения и профилактики протейной инфекции – это чрезвычайно актуальная проблема современной фармацеи. Бактерии рода Proteusявляются возбудителями внутрибольничных инфекций, энтеритов у детей и взрослых людей, способны вызывать воспалительные процессы мочевыводящих путей, быть причиной послеоперационных и ожоговых осложнений, сепсиса, дисбактериоза, токсикоинфекций и других заболеваний. У животных вызывают заболевания желудочно-кишечного тракта, маститы и раневые инфекции [1].

Протейный фаговый биопрепарат будет лизировать только бактерии своего рода и будет абсолютно безопасен для других видов микроорганизмов, в отличие от традиционной формы лечения протейной инфекции при помощи антибиотиков. Применение фаговых препаратов позволит избежать осложнений, которые наблюдаются после антибиотикотерапии. Низкая себестоимость, простота изготовления, срок годности в течение 1 года и высокая эффективность биопрепарата делают проект коммерчески выгодным [3,4].

Целью наших исследований является подбор оптимального набора выделенных фагов бактерии рода Proteus и сконструировать на их основе новый биопрепарат.

Материалы и методы

Штаммы бактерий.В работе были использованы 2 штамма бактерии рода Proteus, выделенные из объектов ветеринарного надзора и патологического материала: P. vulgaris 261, P. vulgaris 3.

Штаммы фагов бактерий рода Proteus, выделенные из фекалий молодняка сельскохозяйственных животных и сточных вод животноводческих хозяйств Ульяновской и Самарской областей.

Бактериофаг П-261 УГСХА. Бактериофаг выделен из сточных вод с. Новая Беденьга Ульяновской области в 2004 году. Индикаторная культура P. vulgaris 216. Титр фага 1,8х10⁹ фаговых корпускул в 1 миллилитре, титр по Аппельману 10^-8. Размер негативных колоний 6,0 - 8,0 мм.

Бактериофаг П-16 УГСХА. Бактериофаг выделен из сточных вод п. Октябрьский Ульяновской области в 2004 году. Индикаторная культура P. vulgaris 3. Титр фага 2,0х10⁹ фаговых корпускул в 1 миллилитре, титр по Аппельману 10^-8. Размер негативных колоний 2,0-3,0 мм.

Питательные среды и реактивы. Для бактериологического исследования использовали питательные среды: мясопептонный бульон, мясо-пептонный агар, 0,04% спиртовый раствор генцианвиолета.

Оборудование:холодильники бытовые, ультратермостаты УТ-15У4,2; термостаты ТС-80М-2, центрифуги лабораторные ОПн-8УХЛ4,2 и ЦЛС-3, весы чашечные с разновесами, автоклав, шуттель-аппарат, сушильный шкаф, водяная баня, пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0; 10 см³; флаконы емкостью 50, 100, 200 см³; стекла предметные, чашки Петри, пробирки.

В результате исследований ранее нами были изучены основные биологические свойства выделенных нами протейных бактериофагов, для конструирования биопрепарата на их основе было отобрано 2 фага бактерий рода Proteus(П-16 УГСХА и П-261 УГСХА). Установлено, что фаги П-261 УГСХА и П-16 УГСХА не лизировали ни одну из культур гетерологичных родов. На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что селекционированные фаги П-261 УГСХА и П-16 УГСХА являются специфичными по отношению к бактериям рода Proteus и могут использоваться для фагоиндикации и фагоидентификации вышеназванных бактерий. При проведении исследований по изучению изменений литической активности указанных фагов при хранении в течение 12 месяцев было установлено, что фаги П-16 и П-261 серии УГСХА не значительно изменяют показатели своей литической активности при хранении в течении 1 года. Этот показатель отрабатывался для разработки технологических параметров изготовления биопрепарата из фагов П-16 и П-261 серии УГСХА промышленным способом и определения его срока годности.

Для изготовления индикаторных протейных бактериофагов использовали штаммы фагов П-16 УГСХА и П-261 УГСХА и культуры: P.vulgaris 261 и P.vulgaris3. Протейные индикаторные бактериофаги изготавливали путем культивирования в питательном бульоне (рН 7,4-7,6) с индикаторными культурами для фага П-16 УГСХА – P.vulgaris3и для фага П-261 УГСХА – P.vulgaris261. Индикаторные культуры хранили на полужидком МПА (рН 7,2-7,4) с содержанием 0,2-0,3 % МПА при температуре 2-4 ⁰С. Культуры, поддерживаемые на полужидком МПА, пересевали каждые 2-3 месяца.

Морфологические, культуральные, ферментативные свойства производственных штаммов культур P.vulgaris 261и P.vulgaris3 проверяли перед использованием их в производстве не реже одного раза в 6 месяцев.

Биологические свойства производственных культур

Морфологические свойства. Культуры P.vulgaris 261 и P.vulgaris3, которые используются в производстве бактериофагов П-16 и П-261 серии УГСХА, представляли собой грамотрицательные палочки, не образующие спор и капсул. Морфология микроорганизмов изучали на мазках, окрашенных по Граму. Подвижность определяли в висячей или раздавленной капле, а также путем посева в полужидкий агар.

Культуральные свойства. Для определения культуральных свойств культуры P.vulgaris 261 и P.vulgaris3 высевали на среду Эндо в чашках Петри и в МПБ, выращивали при температуре 37 ⁰С в течение 18 часов в условиях термостата. На среде Эндо характерной особенностью для вышеуказанных штаммов протея являлась способность к «роению» (ползущий рост), выражающаяся образованием на поверхности среды вуалевого налета. В МПБ рост вышеуказанных штаммов протея проявлялся в виде равномерного интенсивного помутнения среды с наличием осадка, который при встряхивании пробирки легко разбивается. На среде Плоскирева штаммы P.vulgaris 261 и P.vulgaris3 образовывали крупные (4-8 мм) полупрозрачные колонии с перламутровым оттенком, среда в зоне роста колоний подщелачивалась и преобретала желтизну. На висмут-сульфит агаре через 24-48 часов культивирования колонии вышеуказанных штаммов протея имели темно-коричневый цвет.

Ферментативные свойства. Характерной биохимической особенностью бактерий P. vulgaris261 и P. vulgaris3 являлась способность образовывать индол, расщеплять мочевину, разжижать желатину, дезаминировать фенилаланин, ферментировать мальтозу, сахарозу, глюкозу; давать отрицательный результат в реакции Фогеса-Проскауэра, не декарбоксилировать орнитин.

Патогенность. Производственные культуры (P. vulgaris261 и P. vulgaris3) в дозе 0,5-1,0 млрд. микробных клеток вызывали гибель белых мышей при внутрибрюшинном заражении. Для проверки патогенности использовали 18- часовые бульонные культуры, в установленой концентрации в 1 млрд. микробных клеток в 1 мл, и вводили белым мышам массой 14-16 грамм по 0,5 мл внутрибрюшинно, используя трех белых мышей. Наблюдение за мышами проводили в течение трех дней. Две мыши из трех погибли в течение трех дней, таким образом, вышеуказанные культуры считали патогенными.

Индикаторные культуры были чувствительны к фагам: P. vulgaris261к фагу П-261 УГСХА и P. vulgaris3 к фагу П-16 УГСХА. Чувствительность проверяли на чашках Петри с 1,5 % МПА по нижеописанной методике.

Основание чашки Петри делили на три сектора. 18-часовую бульонную культуру индикаторного штаммаP. vulgaris261 наносили на чашку с агаром и распределяли шпателем по поверхности МПА для получения сплошного роста бактерий, посевы инкубировали в условиях термостата в течение 15-20 минут при температуре 37 ⁰С. После чего на поверхность среды, в зоне первого сектора, наносили каплю фага П-16 УГСХА возле края чашки и, наклоняя чашку, давали ему стечь в виде дорожки по агару. На второй сектор аналогичным образом наносили каплю фага П-261 УГСХА, на третий сектор - стерильный МПБ для контроля. Посевы в чашках инкубировали при 37 ⁰С. Учет проводили через 16-18 часов. Аналогичным образом исследовали чувствительность культуры P. vulgaris3 по отношению к фагам П-16 и П-261 серии УГСХА. В результате проведенных опытов на месте нанесения фагов П-16 и П-261 серии на газон культур P. vulgaris261 и P. vulgaris3 образовывались зоны лизиса.

Разработка оптимальных количественных параметров соотношения

протейной культуры и гомологичного бактериофага для его селекции

При добавлении фаголизата к культуре бактерий соотношение между количеством корпускул фага и количеством бактериальных клеток выражают понятием множественности фаговой инфекции. При высокой множественности инфекции лизис культуры может наступить очень быстро, однако нарастание титра фага в таком лизате будет сравнительно небольшим (в десятки, сотни раз). Иногда в таком случае на одной бактериальной клетке может адсорбироваться сотни корпускул фага и вследствие их литического фермента на клеточную стенку может произойти лизис бактерии извне прежде, чем развернется в ней внутриклеточное размножение фага. При малой множественности инфекции, когда в молодой культуре первоначально поражаются не все бактериальные клетки, литический цикл развития фага с освобождением нового потомства проходит не один раз. В этом случае титр фага в лизате может возрасти в сотни тысяч раз (Хейс, 1965; Ревенко, 1978). Опытным путем мы проверяли, при каком варианте множественности инфекции происходит максимальное увеличение титра бактериофага в лизате (табл. 1).

Таблица 14 - Зависимость активности фагов от множественности инфекции

Фаг	Вариант	Количество, мл		Соотношение количества корпускул фага на 1 бактериальную клетку	Активность фага после пассажа (количество активных корпускул фага в 1 мл)
		фага	культуры
П-16 УГСХА	1	0,2	0,1	2,0:1	5,2 х 108
	2	0,2	0,2	1,0:1	2,0 х 109
	3	0,2	0,4	0,5:1	1,7 х 109
П-261 УГСХА	1	0,2	0,1	2,0:1	3,4 х 108
	2	0,2	0,2	1,0:1	1,8 х 109
	3	0,2	0,4	0,5:1	1,6 х 109

Таким образом, оптимальная множественность инфекции фага П-16 УГСХА для установления высокого титра фага составляет 1 корпускула фага на 1 бактериальную клетку, фага П-261 УГСХА – также 1 к 1.Установив оптимальную множественность инфекции, разработали схему проведения пассажей бактериофагов П-16 УГСХА и П-261 УГСХА для получения фаголизатов с высокой активностью.

Исходный штамм фага П-16 УГСХА поддерживали на культуреP.vulgaris3 в питательном бульоне, исходный штамм фага П-261 УГСХА поддерживали на культуреP.vulgaris261 в питательном бульоне. Пересев фагов нужно проводить через 3-4 месяца хранения в холодильнике при температуре 2-4 ⁰С.

Перед пересевом фаги пассировали. Схема пассирования: к 4,5 мл питательного бульона добавляли 0,2 мл фага, оттитрованного предварительно по методу Грациа, и 0,2 мл 18-часовой бульонной индикаторной культуры. Контроль: к 4,5 мл питательного бульона добавляли 0,2 мл 18-часовой бульонной индикаторной культуры. Смеси инкубировали в течение 4-6 часов при температуре 37 ⁰С. После наступления лизиса бактерий и просветления среды пробирки с фагами прогревали на водяной бане при температуре 58-60 ⁰ С в течение 30 минут, далее из них проводили пересев (второй пассаж) в пробирку, содержащую 4.5 мл питательного стерильного бульона в объеме 0,2 мл, куда вновь добавляли 0,2 мл 18-часовой бульонной культуры. Проводили 4 пассажа фага. Последующее поддержание фага в лаборатории проводили путем систематического пассирования на индикаторной культуре через каждые 3-4 месяца.

После пассирования фага его пересевали, для чего во флакон с содержанием 200 мл МПБ вносили 9 мл фага с титром 10⁸ корпускул и 9 мл 18-часовой бульонной индикаторной культуры. Контроль: к 4,5 мл питательного бульона добавляли 0,2 мл индикаторной культуры. Смеси инкубировали при 37 ⁰С в течение 4-6 часов. Среда с добавленным фагом и культурой оставалась прозрачной, а в контрольной пробирке наблюдали рост культуры в виде интенсивного помутнения среды с образованием легко разбиваемого при встряхивании осадка. Полученные фаги прогревали на водяной бане при температуре 58-60 ⁰С в течение 30 минут, затем фаги разливали во флаконы по 2 мл. Разлитые во флаконы фаги контролировали на чистоту, стерильность и определяли его титр.

Исходные штаммы фагов имели следующую характеристику: титр фагов по Грациа был 10⁹ корпускул в 1 мл, размер негативных колоний фага П-16 УГСХА равен 2,0-3,0 мм, фага П-261 УГСХА равен 3,0-4,0 мм с зоной неполного лизиса, при инкубации 16 часов. Исходные штаммы фагов лизировали индикаторные и свежевыделенные бактерии рода Proteus.

Питательной средой для приготовления индикаторных бактериофагов служит стандартный мясопептонный или питательный бульон для культивирования микроорганизмов.

Для приготовления маточных фагов П-16 УГСХА и П-261 УГСХА использовали исходные фаги 4-го пассажа на индикаторной культуреP.vulgaris3 для фага П-16 УГСХА и P.vulgaris261 для фага П-261 УГСХА. Их готовили на питательном бульоне (рН 7,4-7,6). Фаг с титром 10⁹ корпускул в 1 мл в объеме 2 мл вносили в колбу с 45 мл питательного бульона (рН 7,4-7,6). В колбу добавляли 2 мл 18-часовой индикаторной культуры. Контроль: к 4.5 мл питательного бульона добавляли 0,2 мл 18-часовой индикаторной культуры. Смеси инкубировали при 37 ⁰С в течение 4-6 часов. Через 3 часа МПБ с добавленным фагом и культурой был прозрачным, а в контрольной пробирке наблюдали рост культуры в виде интенсивного помутнения среды с образованием легко разбиваемого при встряхивании осадка. Полученные по вышеописанной методике фаги П-16 УГСХА и П-261 УГСХА прогревали на водяной бане при температуре 58-60 ⁰С в течение 30 минут.

Затем исходные фаги с титром 10⁹ корпускул в 1 мл, в объеме 20 мл добавляли в колбу с 450 мл питательного бульона. В эту же колбу добавляли 20 мл 18-ти часовой индикаторной культуры. Контроль: к 4,5 мл питательного бульона добавляли 0,2 мл 18-часовой индикаторной культуры. Смеси инкубировали при 37 ⁰С в течение 3 часов. Полученные фаги прогревали на водяной бане при температуре 58-60 ⁰С в течение 30 минут.

Получение индикаторных фагов: в бутыль с 4,5 литрами питательного бульона вносили 20 мл маточного фага в титре 10⁹ корпускул в 1 мл и 20 мл 18-ти часовой индикаторной культуры. В контрольную пробирку с 4,5 мл питательного бульона вносили 0,2 мл 18-часовой индикаторной культуры. Смеси инкубировали при 37 ⁰С в течение 3 часов. Через 3 часа бульонная культура индикаторного штамма лизировалась фагом. В контрольной пробирке наблюдалось помутнение бульона, связанное с ростом культуры. Полученный лизат прогревали на водяной бане при температуре 58-60 ⁰С в течение 30 минут.

Из полученного объема фага отбирали пробу в количестве 30-50 мл для определения чистоты, физических свойств, титра фага по отношению к эталонной культуре, для постановки реакции нарастания титра индикаторного фага в питательном бульоне, искусственно зараженном эталонной культурой, спектра литической активности и специфичности. Контроль по всем показателям проводили до разлива фага во флаконы.

Были получены удовлетворительные результаты контроля, после чего фаги разливали по 2 мл в стерильные флаконы и закатывали. На флаконы с фага наклеивали этикетки с указанием наименования препарата, номера серии, титра и срока годности.

Качество индикаторных протейных фагов П-16 УГСХА и П-261 УГСХА определяли по следующим показателям: внешнему виду, чистоте, титру, степени нарастания титра фага, спектру литической активности и специфичности.

Контроль бактериофагов

Определение внешнего вида. Внешний вид фага определяли путем просмотра флаконов с препаратом в проходящем свете и визуально. Индикаторные фаги не содержали посторонних примесей, лизат был прозрачным желтого цвета.

Определение чистоты. Для проверки на чистоту использовали 3 флакона препарата. Из каждого флакона высевали фаг в объеме 0,1-0,2 мл в пробирки с МПБ, МПА, питательным бульоном, со средой Сабуро и средой Китта-Тароцци и 1-2 мл во флаконы с 80-100 мл МПБ. Высевы проводили в 2 пробирки и 2 флакона с каждой средой из каждого образца. Посевы культивировали при температуре 22 ⁰С и 37 ⁰С. Через 48 часов из жидких сред делали пересевы на МПА, с твердых сред на МПБ. Первичные посевы выдерживали в термостате в течение 10 суток, а вторичные - 8 суток. На питательных средах с посевами не обнаруживалось роста бактериальной микрофлоры и грибов.

Определение титра фагов. Титр фага П-16 УГСХА, проверяемый по методу Грациа (п. 2.2.3.), на эталонной культуре P.vulgaris3 был 10⁹ корпускул в 1 мл. Титр фага П-261 УГСХА, проверяемый по методу Грациа (п. 2.2.3.), на эталонной культуре P.vulgaris261 был 10⁹ корпускул в 1 мл.. Литическая активность фагов П-16 и П-261 серии УГСХА была 10⁹.

Проверка диапазона литической активности фагов. Для изучения спектра литической активности использовали штаммы бактерий рода Proteus. Определение диапазона литической активности бактериофагов проводили на агаровых средах методом нанесения фага на газон культуры. Сущность методики: основание чашки Петри делили бактериологическим карандашом на три сектора. После чего стерильной пипеткой на поверхность агара наносили 3-4 капли 18-часовой культуры каждого штамма протеев. Капли равномерно шпателем растирали по поверхности среды, затем подсушивали чашки при 37 ⁰С в условиях термостата в течение 15-20 минут. Бактериофаг П-16 УГСХА стерильной пипеткой наносили на первый сектор легким прикосновением капли к поверхности агара возле края чашки и, наклоняя чашку, давали ему стечь в виде дорожки по агару. На второй сектор аналогичным образом наносили бактериофаг П-261 УГСХА, на третий – стерильный МПБ для контроля. После подсыхания чашки ставили в термостат на 16 часов при температуре 37 ⁰С. В результате проведенных опытов на месте нанесения штамма фага П-261 УГСХА на газоне сплошного роста культур образовывалась прозрачная зона лизиса на 16 штаммах протеев из 26 исследованных, на месте нанесения штамма фага П-16 УГСХА – на 17 штаммах протеев. Отрицательным считался результат при отсутствии лизиса на газоне роста исследуемой культуры микроорганизмов.

Проверка специфичности фагов. Специфичность индикаторных фагов определяли на штаммах гетерологичных родов и семейств. Проверку проводили на плотных средах, методом нанесения фага на газон культуры. Штаммы гетерологичных видов, родов и семейств (Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Morganella, Klebsiella, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Yersinia, Bacillus, Pseudomonas) не лизировались фагами П-16 и П-261 серии УГСХА (на чашках отмечали наличие роста культуры).

Кондиция бактериофагов.

Бактериофаги представляли собой прозрачную жидкость желтоватого цвета (цвет засеянной среды) и имели титр 10⁷-10⁹. Бактериофаги во флаконах были прозрачными, без посторонних примесей, осадка. Дату изготовления серии исчисляли со дня закупорки флаконов. Срок годности бактериофагов при температуре 2-4 ⁰С 12 месяцев.

В результате исследований былподобран оптимальный набор выделенных фагов П-16 и П-261 серии УГСХА для создания биопрепарата, сконструирован на их основе новый биопрепарат и были разработаны технологические параметры для изготовления биопрепарата на основе протейных бактериофагов для диагностики и лечения протейной инфекции. Используя вышеописанную методику возможно производство созданного биопрепарата в промышленных условиях.

Библиографический список:

1. Золотухин, С.Н. Малоизученные энтеробактерии и их роль в патологии животных / С.Н. Золотухин. – Ульяновск, 2004. – С.29-37.

2. Золотухин, С.Н. Курс лекций по санитарной микробиологии / С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев. – Ульяновск, 2002. – С.29-147.

3. Золотухин, С.Н. Смешанная кишечная инфекция телят и поросят, вызываемая патогенными энтеробактериями / С.Н. Золотухин, Л.С. Каврук, Д.А. Васильев. – Ульяновск, 2005. – С.20-25.

4. Натидзе, Л. Бактериофаги в ветеринарии: реальность и перспективы / Л. Натидзе, С. Ригвава, М. Натидзе, [и др.] // Мат. Межд. семинара «Перспективы использования препаратов бактериофага для превенции и лечения инфекций, вызванных патогенными и условно-патогенными микроорганизмами» 10-11 ноября 2005 года, Грузия. – Тбилиси, 2005. – С.15.

Код для цитирования: Скопировать