VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014

Возбудителями картофельной болезни хлеба являются спорообразующие бактерии Bacillus subtilis и их физиолого-морфологического варианта Bacillus mesentericus. Их основная масса начинает накапливаться в зерне еще во время уборки, попадая в него с пылью, частицами почвы и из других источников, развивается в процессе приготовления хлеба и вызывает его порчу [2,4]. Интенсивность обсемененности зерновой массы зависит от почвенно-климатических условий, технологии послеуборочной обработки растений, длительности хранения, качества очистки поверхности зерна и т. д. [1,3,6].

Актуальность данного исследования заключается в разработке схемы ветеринарно-санитарного контроля пшеничной муки на наличие возбудителей картофельной болезни хлеба (КБХ) с использованием методов фагодиагностики, которая позволит быстро и точно идентифицировать возбудителей картофельной болезни хлеба даже с низкой амилолитической активностью. Исследования были проведены на базе НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО «Ульяновской ГСХА им. П.А. Столыпина».

Объекты для исследований закупались в продовольственных магазинах г. Ульяновска – этомука пшеничная высшего и первого сортов разных товаропроизводителей: ЗАО «Алейскзернопродукт им. С.Н. Старовойтова», ОАО «Вологодский комбинат хлебопродуктов» ОАО «ВКХП»; ОАО «Мельник»; ОАО «Мукомольный комбинат «Воронежский»»; ОАО «Истра-хлебопродукт»; ОАО «Бобруйский комбинат хлебопродуктов»; ООО «Белый Город»; ООО «Росэкспорт»; ОАО «Рязаньзернопродукт»; ООО «Сибирский Мельник»; ОАО «Алтай-Батюшка»; ОАО «Симбирск-мука».

Используя строгую родовую и видовую специфичность выделенных и селекционированных нами бактериофагов, была разработана схема выделения и ускоренной идентификации вышеуказанных микроорганизмов [7,9]. Подготовку и посев проб пищевых продуктов, подлежащих исследованию, проводили в соответствии ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов». В исследованиях использовали муку пшеничную высшего и первого сортов 12-ти производителей.

Пробы муки весом 10 г вносили в стерильные колбы объемом 100 мл, заливали стерильным МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 г исследуемой пробы, последовательно делали разведения продукта в соотношении 1:100, 1:1000 и 1:10000. Полученные смеси встряхивали в шуттель-аппарате в течение 15 минут, прогревали при температуре 75 ⁰С в течение 45 минут для подавления роста энтеробактерий, затем ставили в термостат на 24 часа при 37 ⁰С. Затем надосадочную жидкость исследовали в соответствии со схемой фагоидентификации, представленной на рисунке 1.

На поверхность МПА в чашках Петри пастеровской пипеткой наносили 3-4 капли бульонной 18-часовой культуры выделенных микроорганизмов. Нанесённую культуру равномерно распределяли по поверхности среды стерильным шпателем. Чашки ставили в термостат для подсушивания на 15-20 минут. Чашку делили бактериологическим карандашом на три сектора. На поверхность засеянной среды, в зоне первого сектора, пастеровской пипеткой легким прикосновением капли наносили фаг Bm-10 (Bs-2 УГСХА), на второй сектор аналогично наносили фаг Bm-11 УГСХА (Bs-13 УГСХА), на третий сектор в качестве контроля наносили стерильный МПБ. Наклоняли чашку, чтобы капли стекли в виде дорожки. Чашки оставляли для подсушивания в боксе на 15-20 минут и помещали в термостат на 18 часов при 37 ⁰С. Результат исследований считали положительным, если на месте нанесения фагов на газоне сплошного роста культуры образовывалась прозрачная зона лизиса с вторичным ростом фагорезистентных микроорганизмов или без него, а также рост негативных колоний фага.

Экспериментальным путем было установлено, что 6 проб было контаминировано бактериями Bacillusmesentericus и Bacillus subtilis. Из литературных источников известно, что качество муки можно считать хорошим, если в ней содержание спорообразующих аэробных бактерий (САБ)– возбудителей картофельной болезни хлеба не более 200 КОЕ/г (КОЕ – колониеобразующих единиц). Известно также, что мука, содержащая до 10 КОЕ/г САБ, считается слабо, до 100 КОЕ/г умеренно, более 1000 КОЕ/г сильно зараженной. В наших исследованиях только 1 проба муки была сильно зараженной (ОАО «Мельник»). Одна проба муки была слабо зараженной (ЗАО «Алейскзернопродукт им. С.Н. Старовойтова) и четыре пробы муки были умеренно зараженными (ОАО «Алтай-Батюшка», ООО «Росэкспорт», ОАО «Бобруйский комбинат хлебопродуктов», ОАО «Истра-хлебопродукт»).

Для подтверждения полученных результатов нами были проведены исследования по изучению биохимических свойств выделенных нами и идентифицированных как возбудители КБХ бактерий.

Микроскопия мазков (рис.2), окрашенных по методикам Грама, Ольта и Ауески, подтвердила, что выделенные нами бактерии – это грамположительные тонкие палочки, располагаются одиночно, в виде нитей или цепочек. Они содержат овальные споры, не превышающие в поперечнике ширины микробной клетки. Капсулу не образуют.

Для дальнейших исследований отбирались колонии, которые на плотной питательной среде образовывали колонии мучного цвета, мелко складчатые, на мясо-пептонном бульоне растущие в виде морщинистой пленки.

Рис. 1. Схема фагоидентификации

Рис.2. Выделенные бациллы под микроскопом (увеличение х90)

В результате проведенных исследований нами были выделены методом фагоидентификации из шести проб муки пшеничной 12 культур спорообразующих бактерий, которые мы классифицировали по биологическим свойствам (на основании тестов, описанных в литературных источниках и результатах изучения биохимических свойств штаммов Bасillussubtilis 6633 и Васillusmesentericus 66, полученных из музея НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО «УГСХА им. П.А. Столыпина»), и отнесли их к виду Васillussubtilis6 культур и к виду Васillusmesentericusтакже 6 культур.

Установлено, 50 % проб муки, присутствующей на продовольственном рынке г. Ульяновска в той или иной степени контаминирована возбудителями картофельной болезни хлеба. Процентное соотношение выделенных из этих проб культур составляет 1: 1 Bасillussubtilisи Васillusmesentericus, соответственно.

Споровые бактерии, попадая в организм человека, способны вызывать очень серьезные нарушения функционирования иммунной системы, желудочно-кишечного тракта, печени, органов дыхания, нервной системы. Поэтому, даже если споровые бактерии не вызывают органолептически выраженной картофельной болезни хлеба, все же их наличие в готовых изделиях нежелательно [5,8].

Библиографический список

1. Асколонов, С.П. Пищевые заболевания, вызываемые спорообразующими бактериями Bacillussubtilis и Bacillusmesentericus / С.П. Аскалонов, А.И. Ильчерко // Вопросы питания. – Киев: Госмедиздат УССР. – 1962. – С.226-229.

2. Афанасьева, О.А. Микробиологический контроль хлебопекарного производства / О.А. Афанасьева. - М.: Пищевая промышленность, 1976. - С. 113.

3. Бахаровская, Е.О. Роль бактерий вида Bacillusmesentericusв контаминации объектов санитарного надзора / Е.О. Бахаровская, Н.А. Феоктистова, М.А. Юдина [и др.]// Аграрная наука – сельскому хозяйству / Материалы VI Международной научно-практической конференции. – Барнаул, 2011. – С. 353-355.

4. Витавская, А.В. Биологическая защита хлеба от картофельной болезни хлеба / А.В. Витавская, Г.Н. Дудикова, К.А. Тулемисова. – Алматы, 1998. – С. 432.

5. Омельченко, В.Д. Зерна, поврежденные и испорченные микроорганизмами и самосогреванием как критерий санитарно-гигиенического состояния пшеницы и кукурузы / В.Д. Омельченко - Автореф. дисс. канд. техн. наук. - М., 1991. – С. 19.

6. Пучкова, Л.И. Технология хлеба / Л.И. Пучкова, Р.Д. Поландова, И.В. Матвеева – СПб.: ГИОРД, 2005. – с. 46.

7. Юдина, М.А. Диагностика картофельной болезни хлеба, вызываемой бактериями видов Bacillussubtilis и Bacillusmesentericus/ М.А. Юдина, Д.А. Васильев, Е.О. Бахаровская [и др.] // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. – 2011. – №1 (13). – C. 61–67.

8. Юдина, М.А. Роль бактерий вида Bacillusmesentericus в контаминации объектов санитарного надзора / М.А. Юдина, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев [и др.] // Аграрная наука – сельскому хозяйству: материалы VI международной научно-практической конференции. – Барнаул, 2011. – Т. 3. – С. 353–355.

9. Юдина, М.А. Методы выделения бактериофагов бактерий Bacillus/ М.А. Юдина, Н.А. Феоктистова, В.А. Макеев [и др.] // Вестник Ветеринарии. – 2011.– №4. – С.88–89.