VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014

В начале 80-х годов ничто еще не предвещало того непрерывно растущего интереса к изучению биологически активных метаболитов морских микроорганизмов и развития морской микробной биотехнологии, которой мы наблюдаем сейчас. Более того, в нашей стране в то время получило широкое распространение мнение о том, что штаммы морских микроорганизмов таксономически не оригинальны и привнесены в море с ветром и стоками рек. Затянувшаяся дискуссия по этому поводу не способствовала интересу к морской микробиологии. А ведь еще в начале нашего века, особенно в конце 40-х и в 50-е годы, пионерами морской микробиологии Б.Л. Исаченко, К.Э. Зобелл и др. были сформулированы критерии, позволившие говорить об истинно морских микроорганизмах.

Только дальнейшее развитие знаний показало, что морской среде обитания в самом деле присущи особые таксоны бактерий, архей, а так же грибов и других микроскопических эукариот, и жизнь океана, как и всей биосферы в целом, невозможна без метаболической деятельности прокариот(Zobell C.E,1944). За последние 15 лет был накоплен опыт, сложилась культура работы с морскими микроорганизмами и их метаболитами.(Михайлов В.В., Плисова Е.Ю)

Морские микроорганизмы являются важной составной частью морских экосистем.Развиваясь в природных условиях и утилизируя многие органические и неорганические вещества, бактерии образуют самые различные метаболиты, действующие в частности на минеральные компоненты окружающей среды.(Волков М.Ю., Ткаченко Е.И.,2007) играя существенную роль в процессах трансформации и минерализации органического материала в морской среде.

Важная роль микроорганизмов заключается в способности синтезировать разнообразные биоактивные метаболиты. Наиболее распространенными метаболитами морских микроорганизмов являются цитотоксические соединения, что необычно и отличает морские микроорганизмы от почвенных и пресноводных. Большое число морских микроорганизмов является продуцентами антибиотических соединений и иммунотропных соединений.(Федосов Ю.В., Михайлов В.В) Наличие гидролитических ферментов, обнаруженных у морских бактерий, способствует микробной деградации молекул агара, хитина, каррагинана, крахмала, нуклеиновых кислот.

В последнее время морские микроорганизмы привлекают внимание исследователей в качестве источников новых биологически активных веществ. Это связано с огромным разнообразием условий существования морских микроорганизмов, малой изизученностью, а так же обмена генетическим материалом между различными прокариотами(Zobell C.E). Метаболиты морских прокариот могут быть использованы не только в области биомедицины, но и как эмульгаторы, адгезины, сурфактанты, для производства биодеградабельного пластика и даже получения искусственного снега (Дебабов В.Г, 1999). Область применения метаболитов широка и разнообразна-это пищевая и химическая промышленность, медицина, экология, научные исследования и т.д. Такой интерес связан с тем, что бактериальные клетки способны расти на сравнительно дешевых средах, имеют очень высокую скорость роста, благодаря чему происходит быстрое накопление микробной массы.

Разнообразие и особенности, синтезируемых морскими бактериями метаболитов, вызывает огромный интерес для дальнейшего, более подробного изучения этих соединений и использования их в различных областях.(Maltsev I.I., Stonik V.A.,1984)

Цель и задачи исследования:

Цель – на основании данных литературы показать разнообразие метаболитов морских микроорганизмов и описать их характерные свойства.

Задачи:

1. Дать отличительные характеристики морских микроорганизмов;

2. Показать воздействие факторов среды на биологические свойства морских микроорганизмов;

3. Охарактеризовать особенности метаболизма бактерий и стадий образования метаболитов;

4. Описать биологически активные вещества морских бактерий ;

5. Описать межметаболитное взаимодействие между морскими бактериями.

Материалы и методы

Информационные источники

В работе были использованы:

1) библиотека ДВФУ

2) краевая научно-медицинская библиотека

3) электронная библиотека ВГУЭС

4) научная библиотека ДВО РАН

5) городская библиотека г. Находки

6) интернет источники

7)сайты:

a)http://www. anrb.ru/inbio/dissovet/index.htm;

б)http://www.elibrari.ru;

в)http://microbewiki.kenyon.edu;

г) http://mikrobio.ho.ua/mikro-text12.html;

д) http://molbiol.ru/wiki;

8) журналы:

1)"Известия Академии наук. Серия химическая"

2)"Химияприродныхсоединений"

3)"LettersinAppliedMicrobiology"

4) "Вестник" ДВО РАН

Исследователи:

А. Серте, Б.Фишер - пионеры морской микробиологии

Б.Л. Исаченко. Первый в нашей стране начал систематическое изучение бактерий океана. Создал отдел морской микробиологии

К. ЗобеллВ 1946 г.- монография «Морская микробиология»

Так же можно отметить микробиологические исследования океана под общим руководством директора Института микробиологии РАН академика М.В. Иванова, известны работы И.Е. Мишустиной, И.Н. Мицкевич, Б.В. Громова, Ю.И. Сорокина и др. микробиологов.

Глава 1.Отличительные особенности морских микроорганизмов

Специфическая морская среда и повышенная потребность в химической регуляции межвидовых и внутривидовых отношений наложили отпечаток на особенности химического строения вторичных метаболитов морского происхождения. Многие исследователи отмечают способность морских организмов утилизировать некоторые растворенные в воде компоненты и включать их в состав своих метаболитов. К таким компонентам относятся галогены, прежде всего бром, а также сульфат-анион (Громов Б.В., Павленко Г.В). На жизнедеятельность бактериальных клеток влияют колебания температуры Мирового океана, освещенность и давление, которое они испытывают на разных глубинах, циркуляция воды, газовый обмен, соленость окружающей среды и наличие в ней органических и минеральных веществ. Все эти условия обитания морских микроорганизмов оказывают влияние на метаболизм клеток, что проявляется в их способности синтезировать необычные, по сравнению с наземными организмами, соединения. Морские бактерии являются продуцентами физиологически активных веществ: внеклеточных РНК-аз, ДНК-аз и их ингибиторов, новых рестриктаз, а-галактозидазы, эластазы, щелочной фосфатазы, ингибиторов вирусной ревертазы, а- и р-глюкозидаз, антиопухолевых веществ, антивирусных соединений, антибиотиков, кардиотоников и иммуномодуляторов, токсинов, сигнальных соединений, пигментов (5) Обитая в толще воды бактериальные клетки могут постоянно обмениваться своими метаболитами. Так же большинство морских бактерий филогенетически значительно древнее организмов суши.

Всестороннее исследования микробов - Тестирование 8 тыс. морских микроорганизмов на способность синтезировать активные метаболиты позволило сделать заключение о распространении микробных продуцентов. Наиболее распространенными метаболитами микроорганизмов всех изученных групп животных являются цитотоксические соединения.

Велико число микроорганизмов-продуцентов антибиотических соединений в штаммах асцидий, горгонарий, морской воды и донных осадков

Судя по результатам исследований, перспективы морской микробиологии просматриваются по крайней мере в двух направлениях. Это - поиск микробных продуцентов биоактивных веществ с необычной структурой и действием, а также выявление истинных продуцентов метаболитов, ранее отмеченных для макрогидробионтов.

Глава 2.Метаболизм бактериальной клетки

Особенности метаболизма у бактерий:

1) многообразие используемых субстратов;

2) интенсивность процессов метаболизма;

3) направленность всех процессов метаболизма на обеспечение процессов размножения;

4) преобладание процессов распада над процессами синтеза;

5) наличие экзо– и эндоферментов метаболизма.

В процессе метаболизма выделяют два вида обмена:

1) пластический (конструктивный):

а) анаболизм (с затратами энергии);

б) катаболизм (с выделением энергии);

2) энергетический обмен (протекает в дыхательныхмезосомах):

а) дыхание;

б) брожение.

В зависимости от акцептора протонов и электронов среди бактерий различают аэробы, факультативные анаэробы и облигатные анаэробы. Для аэробов акцептором является кислород. Факультативные анаэробы в кислородных условиях используют процесс дыхания, в бескислородных – брожение. Для облигатных анаэробов характерно только брожение, в кислородных условиях наступает гибель микроорганизма из-за образования перекисей, идет отравление клетки.

В микробной клетке ферменты являются биологическими катализаторами. По строению выделяют:

1) простые ферменты (белки);

2) сложные; состоят из белковой (активного центра) и небелковой частей; необходимы для активизации ферментов.

Различают также:

1) конституитивные ферменты (синтезируются постоянно независимо от наличия субстрата);

2) индуцибельные ферменты (синтезируются только в присутствии субстрата).

Набор ферментов в клетке строго индивидуален для вида. Способность микроорганизма утилизировать субстраты за счет своего набора ферментов определяет его биохимические свойства.

По месту действия выделяют:

1) экзоферменты (действуют вне клетки; принимают участие в процессе распада крупных молекул, которые не могут проникнуть внутрь бактериальной клетки; характерны для грамположительных бактерий);

2) эндоферменты (действуют в самой клетке, обеспечивают синтез и распад различных веществ).

В зависимости от катализируемых химических реакций все ферменты делят на шесть классов:

1) оксидоредуктазы (катализируют окислительно-восстановительные реакции между двумя субстратами);

2) трансферазы (осуществляют межмолекулярный перенос химических групп);

3) гидролазы (осуществляют гидролитическое расщепление внутримолекулярных связей);

4) лиазы (присоединяют химические группы по двум связям, а также осуществляют обратные реакции);

5) изомеразы (осуществляют процессы изомеризации, обеспечивают внутреннюю конверсию с образованием различных изомеров);

6) лигазы, или синтетазы (соединяют две молекулы, вследствие чего происходит расщепление пирофосфатных связей в молекуле АТФ).

4. Виды пластического обмена

Основными видами пластического обмена являются:

1) белковый;

2) углеводный;

3) липидный;

4) нуклеиновый.

Белковый обмен характеризуется катаболизмом и анаболизмом. В процессе катаболизма бактерии разлагают белки под действием протеаз с образованием пептидов. Под действием пептидаз из пептидов образуются аминокислоты.

Распад белков в аэробных условиях называется тлением, в анаэробных – гниением.

В результате распада аминокислот клетка получает ионы аммония, необходимые для формирования собственных аминокислот. Бактериальные клетки способны синтезировать все 20 аминокислот. Ведущими из них являются аланин, глютамин, аспарагин. Они включаются в процессы переаминирования и трансаминирования(Дебабов В.Г,1999). В белковом обмене процессы синтеза преобладают над распадом, при этом происходит потребление энергии.

В углеводном обмене у бактерий катаболизм преобладает над анаболизмом. Сложные углеводы внешней среды могут расщеплять только те бактерии, которые выделяют ферменты – полисахаридазы. Полисахариды расщепляются до дисахаров, которые под действием олигосахаридаз распадаются до моносахаров, причем внутрь клетки может поступать только глюкоза. Часть ее идет на синтез собственных полисахаридов в клетке, другая часть подвергается дальнейшему расщеплению, который может идти по двум путям: по пути анаэробного распада углеводов – брожению (гликолизу) и в аэробных условиях – по пути горения.

В зависимости от конечных продуктов выделяют следующие виды брожения:

1) спиртовое (характерно для грибов);

2) пропионионово-кислое (характерно для клостридий, пропиони-бактерий);

3) молочнокислое (характерно для стрептококков);

4) маслянокислое (характерно для сарцин);

5) бутилденгликолевое (характерно для бацилл).

По метаболиту, образующемуся в наибольшем количестве, называют соответствующее брожение.

Липидный обмен осуществляется с помощью ферментов – липопротеиназ, летициназ, липаз, фосфолипаз. Липазы катализируют распад нейтральных жирных кислот, т. е. ответственны за отщепление этих кислот от глицерина. При распаде жирных кислот клетка запасает энергию. Конечным продуктом распада является ацетил-КоА.

Биосинтез липидов осуществляется за счет ацетилпереносящих белков. При этом ацетильный остаток переходит на глицерофосфат с образованием фосфатидных кислот, а они уже вступают в химические реакции с образованием сложных эфиров со спиртами. Эти превращения лежат в основе синтеза фосфолипидов.

Бактерии способны синтезировать как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты, но синтез последних более характерен для аэробов, так как требует кислорода.

Нуклеиновый обмен бактерий связан с генетическим обменом. Синтез нуклеиновых кислот имеет значение для процесса деления клетки. Синтез осуществляется с помощью ферментов: рестриктазы, ДНК-полимеразы, лигазы, ДНК-зависимой-РНК-полимеразы.

Рестриктазы вырезают участки ДНК, убирая нежелательные вставки, а лигазы обеспечивают сшивку фрагментов нуклеиновой кислоты. ДНК-полимеразы ответственны за репликацию дочерней ДНК по материнской. ДНК-зкависимые-РНК-полимеразы отвечают за транскрипцию, осуществляют построение РНК на матрице ДНК.

Глава3. Образование метаболитов.

3.1 Стадии образования

Развитие микроорганизмов проходит в несколько фаз:

(1)скрытую — lag

(2)экспоненциальную — log

(3)стационарную — const

(4)отмирания— let

После внесения культуры в питательную среду наблюдается лаг-фаза, когда видимого роста микроорганизмов не происходит; этот период можно рассматривать как время адаптации. Затем скорость роста постепенно увеличивается, достигая постоянной, максимальной для данных условий величины; такой период максимального роста называется экспоненциальной, или логарифмической, фазой. Постепенно рост замедляется, и наступает стационарная фаза. Далее число жизнеспособных клеток уменьшается и рост останавливается.

Следуя описанной выше кинетике, можно проследить за образованием метаболитов на разных этапах:

1) В логарифмической фазе образуются продукты, жизненно важные для роста микроорганизмов: аминокислоты, нуклеотиды, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы и т.д. Их называют первичными метаболитами. Многие первичные метаболиты представляют значительную ценность. Так, глутаминовая кислота (точнее, ее натриевая соль) входит в состав многих пищевых продуктов; лизин используется как пищевая добавка; фенилаланин является предшественником заменителя сахара аспартама(Барбье М,1978).Первичные метаболиты синтезируются природными микроорганизмами в количествах, необходимых лишь для удовлетворения их потребностей.

2) В фазе замедления роста и в стационарной фазе некоторые микроорганизмы синтезируют вещества, не образующиеся в логарифмической фазе и не играющие явной роли в метаболизме. Эти вещества называют вторичными метаболитами. Их синтезируют не все микроорганизмы, а в основном нитчатые бактерии, грибы и спорообразующие бактерии.

Таким образом, продуценты первичных и вторичных метаболитов, относятся к разным таксономическим группам (Безбородов А.М.,1984). Вырабатываемые метаболиты являются биологически активными веществами: одни из них обладают антимикробной активностью, другие являются специфическими ингибиторами ферментов, третьи - ростовыми факторами, многие обладают фармакологической активностью.

3.2Фазы образования метаболитов

На основании положений, сформулированных В. Н. Шапошниковым (1939), каждый продуцент в своем развитии проходит две фазы, названных Ж. Д.Бу'Локком (1961, 1967) трофофазой и идиофазой (от греч trofe —- питание, idios — свой, специфический)

1.Трофофаза

В период трофофазы активно протекают конструктивный и энергетический обмен — в клетках преобладают синтетические процессы, нарастает количество первичных метаболитов и ряда внутриклеточных вторичных метаболитов — липидов, гликанов, глико-конъюгатов, скорость роста и размножения организма при этом высокая, а продукция экзогенных вторичных метаболитов низкая.

2.Идиофаза

В идиофазу скорость роста и размножения низкая, а продукция экзогенных и эндогенных вторичных метаболитов высокая. Продуктивность культуры может быть повышена за счет внесения предшественников метаболитов.

Скорость образования метаболита можно выразить следующим уравнением г/р= - YP/ST

где г — скорость, p — контролируемый продукт метаболизма, YP/ST — коэффициент отношения метаболита (р) к субстрату (s)

3.3Группы метаболитов, продуцируемых бактериями

1.Преметаболиты

К интермедиатам, или преметаболитам относятся простые сахара, аминокислоты, нуклеиновые основания и др.Это информационные молекулы ДНК и РНК вычленены из состава других реакций, хотя их синтез и распад (прерывистые стрелки) также катализируются ферментами

2.Первичные метаболиты

В основном первичные метаболиты представлены как продукты матричного синтеза, то есть белки

а) ферментные белки

б) неферментные белки

К реакциям первичного обмена относят образование и расщепление нуклеиновых кислот и оснований, белков и их предшественников, а также большинства углеводов, липидов, некоторых карбоновых кислот,ферментов амилаз и L-аспарагиназ — для здравоохранения, пишевой, текстильной промышленности и др. (Федосов Ю.В., Михайлов В.В,2000).

Ферменты и ферментные системы могут функционировать invitro, однако их источником являются живые организмы, содержащие генетическую программу о синтезе первичных метаболитов, или ферментов.

3.Вторичные метаболиты

Вторичные метаболиты представляют собой продукты реакций, катализируемых ферментами (Н. П. Блинов, 1979) .

К реакциям вторичного обмена относят те из них, которые сопровождаются образованием алкалоидов, антибиотиков, триспоровых кислот, гиббереллинов и некоторых других веществ, расцениваемых несущественными для продуцента. Из вторичных метаболитов хорошо известны поликетидные антибиотики — тетрациклины, продуцируемые некоторыми стрептомицетами. Они образуются путем конденсации молекул малонилКоА.

Глава 4.Коммуникативные связи бактерий за счет выделяемых метаболитов

Быстро выросший за последние годы интерес к коммуникативным связям бактерий объясняется осознанием высокой значимости этих вопросов для решения научных и практических задач в области биотехнологии, медицины, здравоохранения и сельского хозяйства. В настоящее время механизмы коммуникации преимущественно связывают с так называемым «чувством кворума» (Fuquaetal., 1994) - способностью бактерий «ощущать» плотность собственной популяции путем выделения и последующей рецепции особых низкомолекулярных соединений – автоиндукторов. Автоиндукторами могут являться как специализированные соединения, так и не специализированные вещества-метаболиты. Существуют данные, свидетельствующие о том, что в регуляции задействованы неспециализированные метаболиты, например индол, метанол (Сидоренко М.Л., Бузолева Л.С,2012) и даже обычные (кодируемые) аминокислоты.

Автоиндукторыучаствуют в регуляции самых различных процессов, перечень которых постоянно расширяется. К ним относятся: биолюминесценция, споруляция, агрегация, формирование биопленок, плодовых тел и клеток-швермеров, конъюгация, синтез антибиотиков, экзоферментов, факторов вирулентности и некоторых других соединений. Синтез самих автоиндукторов зависит от плотности популяции, однако до сих пор остается дискуссионным вопрос о том, контролируется ли она собственными внутрипопуляционными механизмами или полностью определяется внешними факторами (состав среды, аэрация, температура, рН и т.д.), то есть регулируется на более высоком уровне (микробиоценоз или искусственное поддержание параметров среды) (Кировская Т.А, 2005).В свою очередь, доминирующие популяции микроорганизмов контролируют рост и развитие других групп микроорганизмов. Осуществление подобного контроля происходит в результате симбиотических или антагонистических взаимоотношений между микробами (Тирранен Л.С., Ковров Б.Г,1980). Положительные микробные взаимодействия способствуют возникновению особых условий, когда рост одной популяции порождает возможность развития другой популяции микроорганизмов. Микробный симбиоз предполагает снабжение организмов одной группы жизненно важными для них метаболитами другой или удаление одной группой микроорганизмов токсических продуктов метаболизма другой. Практически все микробные метаболиты активны и могут выступать как ингибиторы или стимуляторы развития отдельных групп микроорганизмов, а значит как регуляторы качественного состава и численности популяций микроорганизмов в биоценозе

Согласно установленным в экологии закономерностям, полноценная система саморегуляции численности и развития популяций должна включать 4 основные регуляторные связи, обеспечивающие оптимальные для данных условий скорость размножения и продолжительность жизни (выживаемость) организмов. Это позволяет отнести к контролирующим численность и развитие популяций микроорганизмов следующие связи:

1) положительная обратная связь, обеспечивающая инициацию и последующий рост культуры

2) отрицательная обратная связь, способствующая замедлению роста, его остановке и адаптации культуры к новым условиям еще до полного исчерпания субстрата

3) положительная обратная связь, повышающая выживаемость бактерий при оптимальной для данных условий плотности культур

4) отрицательная обратная связь, приводящая к снижению выживаемости, если плотность культуры по какой-то причине превысила оптимальный уровень (Ю. А. Израиль)

В настоящее время установленным для бактерий можно считать только наличие отрицательной обратной связи, обеспечивающей остановку роста культуры. Эксперименты с культурами высокой плотности в 70-е - 80-е годы прошлого века показали, что функции ингибиторов роста выполняют накапливающиеся в среде продукты метаболизма: кислоты (муравьиная, уксусная, молочная, пропионовая и др.), спирты (метанол, этанол, пропанол и т.д.) и некоторые другие соединения.

Значительно меньше известно об автостимуляторах роста. Содержащие эти соединения фильтраты культуральных жидкостей используются на практике для ускорения роста микроорганизмов или для реактивации их покоящихся форм (Герхардт Ф, 2005), однако информация относительно природы и биологических свойств самих автостимуляторов весьма ограничена и противоречива. По одним сведениям бактерии выделяют эти соединения преимущественно в лаг-фазе, по другим - на протяжении всего роста. Безуспешными оказались и все известные попытки идентифицировать автостимуляторы, включая и самые последние из них (Okami Y., Hotta K, 2001). Практически неизвестными до сих пор оставались явления саморегуляции выживаемости бактерий. В последние годы эти вопросы рассматриваются в литературе с позиций программируемой клеточной гибели (апоптоза) бактериальных культур (Kabori H., Sullivan C.W, 1999), направленной преимущественно на лизис зараженных вирусом бактерий и обеспечение за их счет питательными веществами оставшихся клеток.

Впервые доказано существование и изучены свойства негативных регуляторов выживаемости бактерий (УГ-факторов) - низкомолекулярных экзометаболитов, ускоряющих гибель клеток при высокой плотности их популяции (Вахитов Т.Я., Момот Е.Н, 2005).

Разработаны методы выделения автостимуляторов роста микроорганизмов. С использованием этих методов впервые идентифицированы автостимуляторы роста бактерий, которыми для E.coli М-17 оказались янтарная и глутаминовая кислоты.

Получены новые данные относительно биологической активности ацетата: впервые показано, что ацетат является не только ингибитором, но и стимулятором роста бактерий и может выполнять функции плотностно-зависимого регулятора развития их популяций. Предложено новое объяснение, согласно которому выделение ацетата и других метаболитов обусловлено их регуляторными функциями на популяционном уровне, а не наличием «дефектов» в организации внутриклеточного метаболизма. Показано что идентифицированные автостимуляторы, а также ряд других аналогичных соединений (аминокислот, продуктов брожения и т. д.), могут осуществлять коммуникативные функции на межвидовом уровне, например стимулировать рост собственного штамма и подавлять развитие других штаммов, и наоборот, регулируя таким образом соотношение видов в смешанных культурах и микробиоценозах.

Созданы не имеющие аналогов искусственные (модельные) композиции метаболитов бактерий, не отличающиеся по биологическим свойствам от нативных растворов метаболитов или значительно превосходящие их по способности стимулировать рост бактерий. Впервые выдвинуто положение о возможности использовать эти композиции для нормализации состава и повышения физиологической активности собственной микрофлоры хозяина. В опытах на лабораторных животных показана эффективность подобной композиции (Актофлор-С) при коррекции дисбиотического состояния и в лечении язвенного процесса.

Это создает теоретические предпосылки для реконструкции эволюции регуляторных систем, начиная от регуляторных функций элементарных метаболитов (СО2, N0, НСООН, СН3СООН, аминокислот и других простейших органических веществ) и кончая сложными соединениями пептидной, белковой или иной природы.

Первый этап был посвящен выявлению фактов саморегуляции в процессе роста и голодания бактерий.

На втором этапе с использованием хроматографических и других физико-химических методов была проведена идентификация регуляторов роста бактерий.

Одновременно (3-й этап) изучались биологические свойства выделенных низкомолекулярных экзометаболитов.

Согласно полученным данным, каждое (или большинство) из выделяемых соединений выполняет определенные коммуникативные функции: обеспечивает рост и развитие популяции, ее взаимодействие с другими популяциями или участвует в поддержании коммуникативных связей с организмом хозяина.

Глава5. Продуценты физиологически активных веществ

5.1 Виды бактерий-основных продуцентов

Класс Proteobacteria

Род Pseudomonas

Аэробные гетеротрофные грамотрицательные бактерии. Широко населяют биосферу и принимают активное участие в процессах минерализации органических соединений, очистке окружающей среды от загрязнения.

К морским видам псевдомонад можно отнести P. Doudoroffii, P. elongata, P. nautica, P. perfectomarina, P. stanieri, могут также встречаться штаммы P. fluorescens.

Бактерии этого рода обычны в море и часто встречаются в микрофлоре донных вод, но на поверхности отложений их присутствие существенно ограничено. Не способны выжить в глубоководных донных осадках.

Бактерии рода Alteromonas

Составляют значительную часть микробной биомассы моря и могут быть выделены из каждого образца воды. Род Alteromonas включает в себя только A. macleodii, а остальные виды следует относить к роду Pseudoalteromonas. Это A. atlantica, A.aurantia, A.carrageenovora, A.citrea, A. denitrificans, A.espejiana, A.haloplanctis, A.luteoviolacea, A. macleodii, A.rava, A.rubra, A.tatraodonis.

Семейство Vibrionaceae

Род Vibrio

Виды этого рода- прямые или изогнутые палочки, эндоспор и микроцист не образуют, грамотрицательные, имеют один или несколько полярных очехленных жгутиков, факультативные анаэробы с ферментативным метаболизмом, хемоорганотрофы. Род Vibrioразнороден. Морские виды включают V. Aestuarianus, V. alginolyticus,V. campbellii, V.damsel,V. diazotrophicus,V.gazogens, V.harveyi,V. marinus, V.mideterranei, V.natriegens, V.nereis, V.orientalis, V.salmonicida,V.mytili,V.tapetis,V.logei, V.fischeri. Они либо отсутствуют, либо присутствуют в незначительных количествах в пелагических водах и глубоководных отложениях. Обладают ферментами способными разлагать сложные природные полимеры.

Семейство Enterobacteriaceae

Включает 2 истинно морских вида-краснопигментированный (продигиозин-пигмент) Serratiaribidaeaкаталазоположительные,оксидазоотрицательны,движутся с помощью перитрихиально расположенных жгутиков. Второй- Pasteurellapiscicida

Другие протеобактерии

Описаны морские виды рода Ocaenospirillum. O. beijerinckii, O.communa, O. jannashi,O. minutilum, O.pusillum, O.maris. Бактерии не разлагают крахмал и казеин и не катаболируют сахара

Фиолетовопигментированные (с различными оттенками) палочки с единственным полярным жгутиком, встречающиеся в море и принадлежат как правило либо к роду Chromobacterium, либо к роду Janthinobacterium

Цитофаги

Грамотрицательные пигментированные бактерии, способные к скользящему движению, разделены были прежде на 4 семейства. К роду Cytophaga относятся бактерии, синтезирующие желтые, оранжевые и красные каратиноидные пигменты. Это хемоорганотрофы с дыхательным типом метаболизма. Особенностью цитофаг является их способность деполимеризоватьагар, целлюлозу и хитин. Близки также к цитофагамспороцитофаги и бактерии рода Flavobacterium.

Класс Actinobacteria

В настоящее время актиномицеты и близкие к ним бактерии отнесены в класс Actinobacteria. К этому же классу относятся пропионовые бактерии, бревибактерии, микрококки, бифидобактерии, франкии, микобактерии, коринебактерии и другие грамположительные бактерии. Из проб пляжей, прибрежных вод и донных осадков могут быть выделены представители рода Micromonosporaspи. Streptomycessp. Часто выделяют из донных отложений. Нередко можно выделить бактерии относящиеся к Nocardia; Rhodococcus- Эти бактерии неподвижны, солезависимы, каталазоположительны, разлагают экулин и тирозин, желатин, крахмал, ксантин и мочевину. Их колонии окрашены в красный, оранжевый или кремовый цвет.

Фирмикуты с низким молярным процентом ГЦ в ДНК.

К роду Bacillus относятся бактерии, которые образуют устойчивые эндоспоры. Это строгие или факультативные анаэробы. Бациллы распространены повсеместно.

5.2.Распределение микробных продуцентов биоактивных веществ в море

Тестирование нескольких тысяч штаммов морских микроорганизмов на способность синтезировать активные метаболиты позволило сделать заключение о распространении микробных продуцентов. Наиболее распространенными метаболитами микроорганизмов всех изученных групп являются цитотоксические соединения, что необычно и отличает морские микроорганизмы от почвенных и пресноводных. Велико число микроорганизмов – продуцентов антибиотических соединений и противовирусных веществ. По мнению исследователей, ингибирование энтеровирусов связано с метаболитической активностью Vibriomarinus, бактерий родов Flavobacterium, Pseudomonas.Из 535 исследованных штаммов 72 ингибируют активность тимидинкиназы, препараты 16 штаммов ингибируют активность обратной транскриптазы, 12 штаммов ингибировали активность РНК-полимеразы.

Сульфатированные вторичные метаболиты морских организмов относятся к бифильным соединениям: они обладают гидрофильными и гидрофобными структурными фрагментами. Такого рода вещества, с одной стороны, имеют хорошую растворимость в воде и быстро в ней диффундируют, а с другой - легко взаимодействуют с мембранами соответствующих рецепторов у реципиентов

Данные по исследованию этого вопроса показывают,например, что продуценты ферментов следует искать в бореальных областях океана, а цитотоксинов и антибиотиков – в торпической зоне. Таким образом, распространение и распределение микробных продуцентов подчинено некоторым закономерностям.

Глава 6. Биологически активные соединения.

6.1.Продуценты токсинов.

Суругатоксин синтезируется грамположительными неподвижными желтопигментированнымикоринебактериями( Kosuge, 1985)

Палитоксин является одним из самых сильных небелковых природных токсинов. Эти токсины были получены из штамма Vibriosp.

Тетрадоксин – один из самых сильных природных нейротоксинов. Обладает ценными фармакологическими свойствами как анальгетик, средство против астмы, артрита. Способность продуцировать этот токсин была обнаружена у штаммов: Vibrio, Protobacterium, Aeromonas, Plesiomonas,Shewanella.

Продуценты сакситоксина- бактерии родов Alteromonas,Vvibrio

6.2.Продуцентыантиопухолевых веществ (цитотоксинов)

Морские бактерии составляют перспективную группу природных источников для получения противопухолевых соединений.Среди них были отобраны для химических исследований рН-зависимые цитотоксины. Такие вещества обнаружены в экстрактах микроорганизмов из донных осадков, мягких кораллов и морских звезд. Из штамма Bacillussp. (KMM 456) была получена сумма пептидов с цитотоксической активностью, которая увеличивалась в 100 раз при изменении рН среды от 7.0 до 5.6. Масс-спектрометрический анализ показал, что выделенные вещества являются короткими пептидами с молекулярной массой от 1000 до 1460 Д. Химическая структура этих соединений сейчас изучается

В 1977г. Окутани выделили морские бактерии, продуцирующие полисахариды. Некотрые из этих полимахаридов показали антиопухолевую активность.

Один галофильный штамм Flavobacteriumsp. Синтезировал водорастворимый полисахарид, ингибировавший развитие саркомы. Вещество было названо маринактаном.

Серия цитоксичныхмакролактинов А,В,С,D,F, а так же макролактиновая и изомакролактиновая кислоты ингибируют развитие вирусов герпеса и вируса иммунодефицита человека, а так же оказывают ингибирующее действие на развитие меланомы (invitro)

В 2004 году была установлена структура ауреовертицилактама обладающего цитотоксичным действием к различным типам опухолевых клеток. Оно было выделено из Streptomycesaureoverticillatus, полученного из морских донных осадков.

Капролактоны, идентифицированные в липидном экстракте морского стрептомицетаStreptomicetessp. Проявляют значительную активность по отношению к опухолевым клеткам.

Бензантрохинон, выделенный из Chainiapurpurogena, обладает высокой противоопухолевой активностью.

Из бактерии Actinomadurasp. был получен полициклический ксантон, обладающий противоопухолевым действием и ингибирует рост грамположительных бактерий.

Чиникомидины - обладают умеренной противоопухолевой активностью.

Алтемицидин проявлял активность к клеткам лейкимии и карциномы.

Глициапиррол А ингибирует рост клеток аденокарциномы и меланомы.

Салиноспорамиды-цитотоксические соединения, выделенные из Salinisporatropicaингибируют рост вируса герпеса. При исследовании полярных метаболитов этой бактерии были найдены соединения обладающие антибиотической активностью

Ладжоламицин, выделенный из Streptomycesnodosus ингибирует рост и развитие опухолевых клеток.

Первыми метаболитами морских микроорганизмов, рекомендованными для проведения клинических испытаний в качестве противоопухолевых препаратов, были аминогликазидыистамицины. Они были выделены японскими исследователями. Соединения проявляют активность к грамотрицательным и грамположительным бактериям, включая штаммы устойчивые к антибиотикам и обладают противоопухолевым действием. Вещества активны к бактериям рода Staphylococcus, Bacillus, Corinebacterium, Escherichia вещества менее активны к бактериям родов Pseudomonas, Klebsiella.(Семенов А.В.,2011)

Лорнеамид А активен по отношению к Bacillussubtilis(Волков М.Ю., Ткаченко Е.И.,2007)

Паримицин-ингибирует рост человеческих опухолевых клеток рака желудка, рака молочной железы и меланомы.

Пентабромопсевделин-высокобромированный метаболит из бактерии вида Pseudomonasbromoutilis. Вещество обладает противоопухолевой активностью и проявляет высокую фототоксическую активность

Бисукаберин был охарактеризован в качестве метаболита бактерии Alteromonashaloplanctis. Вещество повышает чувствительность опухолевых клеток к цитолизу.

Лагунопироны, выделенные из этого же актиномицета оказались цитотоксичными по отношению к опухолевым клеткам человека.

Сотрудниками сингапурского Института молекулярной и клеточной биологии из морской бактерии Micromonosporasp.были выделены стрептонигрин и его производные. Исследования показали что эти вещества индуцируют апоптоз в клетках человеческой нейробластомы. Комодохиноны, полученные из этой же бактерии индуцировали дифференциацию в клетках нейробластомы.

Хлор-содержащиедигидрохиноны обладают высокой активностью к антибиотик-устойчивым микроорганизмам и ингибируют рост клеток человеческой карциномы, а так же обладают противоопухолевой активностью.

6.3. Продуценты эйкозапентаеновой кислоты

Эйкозопентаеновая кислота (ЭПК) является существено важной для животных. Она поддерживает гомеостаз, эффективна для предупреждения и лечения тромбозов, атеросклероза и др. болезней. Было исследовано и протестировано 15 000 бактериальных культур, 112 из них синтезировали ЭПК. Наибольшее количество этой кислоты синтезировали грамотрицательные подвижные палочки, отнесенные впоследствии к Shewanellapurtrefaciens.

6.4.Продуцентыантивирусных соединений

Важным направлением морской биотехнологии может стать получение противовирусных препаратов. Предпосылкой для поиска среди морских бактерий таких соединений послужило утверждение, что некоторые вирусы инактивируются в морской среде. По мнению большинства исследователей, ингибирование энтеровирусов связано с метаболической деятельностью морских Vibriomarinus, бактерий родов Flavobacterium, Pseudomonas. Й. Камеи с коллегами показал, что 52% штаммов микроорганизмов из прибрежной зоны острова Хоккайдо имели заметную и 11% - очень высокую активность по отношению к патогенным для рыб вирусам.

Исследователи группы В. Феникала выделили грамположительную бактерию, которая выделяла новые антивирусные макролиды-макролактины А,В,С,D,F. Эти вещества активны против меланомы, против вируса герпеса и вируса иммунодефицита человека( Gustafson et.al., 1989)

Был проведен отбор источников соединений с противовирусными свойствами по способности метаболитов ингибировать действие ферментов репродуктивного цикла вирусов, в частности вирусной обратной транскриптазы, РНК-полимеразы и тимидинкиназы. Из 535 исследованных штаммов 72 ингибируют активность тимидинкиназы на 50 -100%. Это - штаммы бактерий из губок (13.3%), донных осадков (26.5%), асцидий (17.6%), кишечнополостных (14.6%), морской воды (10.6%). Препараты 16 штаммов (из 224 исследованных) ингибируют активность обратной транскриптазы: среди них наиболее многочисленны (33.3%) микроорганизмы морской воды. Препараты 12 штаммов (из 224 исследованных) ингибировали активность РНК-полимеразы на 50 - 90%. Такая активность обнаружена у 14.3% микроорганизмов, выделенных из кишечнополостных, обитающих вблизи австралийского побережья.

6.5. Продуценты ингибиторов ферментов

Маремицины А и В – новые дикетопиперазины из морского изолятаStreptomicessp.

Мариностатины- пептидные ингибиторы протеаз патогенов ( Alteromonassp.)

Леупептды А,В,С из морской бактерии Alteromonassp. являются тиолпротеиназными ингибиторами.

Особенно удачным оказался поиск ферментов среди бактерий микробных продуцентов нуклеинового обмена. Штамм Alteromonashaloplanktis (KMM 223), выделенный в 1985 г. из образца воды с глубины 2000 м (северо-западная часть Тихого океана), продуцирует уникальный фермент - уридинспецифическую РНК-азу. Этот фермент может применяться в структурных исследованиях больших молекул РНК, например вирусных.

Штамм Bacilluspumilus (KMM 61) синтезирует внеклеточную РНК-азу. Фермент может быть, использован в производстве рибонуклеотидов и рибонуклеозидов из РНК. Другие представители класса бутенолидов были полученные из штамма Streptomycessp. подавляют рост Pseudomonasaeruginosa и ингибируют хитиназу.

6.6.Продуценты антибиотиков

Как упоминалось ранее, первым продемонстрировал антогонистические свойства морских бактерий ( против Bacillusanthracis и Vibriocholerae) де Гиакса в 1889 г. Затем К. Зобелл в 40-50-е годы изучал этот вопрос.Было отработано 58 штаммов. Представители родов Actinomyces, Bacillus, Micrococcus, Serratia продуцировали антибиотические вещества против патогенных тест-культур.(Baam R.B., Gandhi N.M,1966) Были исследованы актиномицеты из прибрежных морских осадков. Около 50% штаммов актиномицетов проявляли антогонизм по отношению к грамположительным ( в основном) и грамотрицательным тест-культурам. На данный момент актиномицеты привлекают внимание исследователей в первую очередь как главные продуценты антибиотиков. ( Tresneret al.,1968; Weyland,1969) К настоящему времени из морских бактерий получено несколько десятков индивидуальных антибиотических веществ, принадлежащих к различным классам химических соединений.

Более 150 штаммов морских актиномицетов родов Nocardia, Streptomyces, MicromonosporaиPromicromonospora стали объектами химических и биохимических исследований. Штамм Streptomycespluricolorescens (KMM Acl) продуцировал антибиотик с ингибирующей концентрацией 0.1-1 мкг/мл. Соединение не обладало цитостатическим действием и не проявляло протеолитической активности. После хроматографических очисток был получен гомогенный препарат антибиотик - пальмиромицин с молекулярной массой 85 КД. Ранее из актиномицетов данного вида не выделяли пептидных антибиотиков со свойствами пальмиромицина, поэтому его дальнейшие химические и биохимические исследования представляют интерес. Изучение метаболитов другого вида актиномицет (Streptomycesparvulus), выделенных из морского грунта литоральной полосы острова Д' Ар-рос (Республика Сейшельские Острова), привело к обнаружению антибиотика - ингибитора роста грамположительных бактерий и грибов. Хроматографическая очистка антибиотического концентрата позволила получить высокоактивный препарат с действующей концентрацией менее 1 мкг/мл. Спектральные исследования свидетельствуют об идентичности нашего антибиотика - актиномицину D.

Бромсодержащиймакролидный антибиотик аплазмомицин (аналог боромицина) из Streptomycesgriseus активен против малярийного плазмодия. Группа аминогликозидных антибиотиков истамицинов из Streptomycestenjimariensis подавляет рост патогенных микроорганизмов, устойчивых к другим антибиотикам.

Самый первый случай- выявление бактерии, продуцирующей бромированный антибиотик. В 1966 году было сообщено о двух антибиотикпродуцирующих штамма. Колонии бактерий продуцировали высокобромированныйпиррольный антибиотик-пентабромопсевдилин, выделеный из Pseudomonasbromoutilis( штамм культивировали на среде, содержащей соевый пептон, дрожжевой экстракт, глюкозу и витамин В12) . Уникальность структуры заключалась в том, что антибиотик содержал более 70%и брома(VanQua D., Simidu U,1981). Антибиотик действовал на грамположительные культуры в концентрациях от 0,0063 до 0,2 мкг/мл.и не действовал на грамотрицательные. Он был активнее, чем пинициллин и показывал антиопухолевую активность и высокую фитотоксичность.

Несколькими годами позднее исследователи группы Дж. Фолкнера из Калифорнии описали фиолоетовопигментированную бактерию Chromobacteriumsp.( культуру выращивали как в жидкой так и в твердой питательной среде 4-14 сут. При температуре 25 градусов),которая была продуцентом антибиотиков. Бактерия синтезировала тетрабромпиррол. Тетрабромпиррол показывал умереную активность против Staphylococcusaureus, Escherichiacoli, Pseudomonasaeruginosa, Candidaalbicans. Культура синтезировала аутотоксичные продукты.

Группа французских ученых под руководством М. Готье особое внимание уделила бактериям рода Alteromonas, пигменты которых проявляли антибиотическую активность. При культивировании штаммов A. luteoviolacea на среде Зобелла( морской агар 2216Е) в среду выделялись два бромированных антибактериальных продукта вместе с полианионными полисахаридами, которые ингибировали рост грамположительных Bacillusfirmus, S.aureus, S.epidirmidis и менее эффективно-грамотрциательных бактерий Morganellamorganii, Shigelladysenteriae.

Несколько позднее из Pseudomonasaeruginosa были выделены псевданы, проявляющие активность к золотистому стафилококку. Два антибиотических пигмента – магнезидины-были изолированы из морской бактерии Pseudomonasmagnesiorubra (Gandhiet al.,1976; Kohletal., 1974) Эта бактерия синтезирует красный пигмент (трипиррол), который так же обладает антимикробными свойствами. Магнезидины первые природные антибиотики, содержащие магний. Было найдено, что галофильная бактерия Vibriogazogenes продуцирует вещества с активностью против Bacillussubtilis. Так же магнезидины были активны по отношению к P.micans и показывали слабую активность против B. subtilis.

Была обнаружена морская бактерия, которая способна продуцировать известный антибиотик аминопирролнитрин, ранее выделенный из наземныхпсевдомонад(Sato К., Okazakiet al.,19847)

В 1975 году из образцов,взятых в заливе Сагами был выделенантибиотикпродуцирующий штамм Сhainiapurpurogena. Вещество ингибировало развитие грамположительных бактерий с минимальной ингибирующей концентрацией 1-2 мкг/мл., было активно против карциномы Эрлиха.

Истамицины А и В- другой пример антибиотиков, изолированных из морского актиномицета( Hottaet al.,1980; Okami, 1993). Истамицины А и В имеют МИК между 0,1-0,3 мкг./мл. против видов Staphylococcus, Bacillus, Corinebacterium, Escherichia и менее активны против видов Pseudomonas, Klrbsiella, Serratia. Важно, что эти вещества действуют на некоторые патогенные штаммы резистентные к другим аминогликозидным антибиотикам.

Из морских осадков того же залива Сагами был изолирован штамм Streptomycessioyaensis (Sato К., Okazaki et.al., 1989), который продуцировал структурно новый алкалоид альтемицидин, содержащий серу и азот. Он активен против лейкемии, проявляет антимикробную активность, но является токсичным. Из актиномицета, выделенного из эстуария реки(Калифорния), изолированы два новых метаболита- маринон и дебромомаринон. Оба вещества действовали против бактерий родов Bacillus, Staphylococcus

Американские исследователи выделили штамм Streptomycessp., проявляющий активность против метициллинчувтвительных и резистентных бактерий Stapholococcusaureus, Enterococcusfaecium. Вещество было названо биоксаломицином.

Морские бактерии Alteromonasrava продуцировали новый антибиотик тиомаринол с высокой антибактериальной активностью против грамположительных и грамотрицательных бактерий (Еляков Г.Б., Стоник В.А, 1986)

Тиомаринол обладает значительно более высокой активностью, чем псевдомоновая кислота ицилпирролитины. Он ингибирует даже очень устойчивые штаммы Staphylococcusaureus.

Штамм Streptomycesplurocolorrescens продуцировал белковый антибиотик-пальмиромицин, ингибирующий развитие грамположительных бактерий.

Бактерии Alteromonassp. Синтезируют изатин. Это вещество используется для синтеза красителей, а его производными являются фунгициды,гербициды, лекарственные препараты.

ЦианобактерияMicrocolleuslyngbijaceus синтезирует хинон, обладающий сильнойфунгициднойактивостью.

Из актинобактерий выделен стрептомицин, обладающий сравнительно невысокой токсичностью и широким спектром антибиотического действия. Кроме стрептомицина был обнаружен еще ряд антибиотиков: неомицины, тетрациклины и хлорамфеникол (применяются в сельском хозяйстве, медицине, пищевой промышленности) Антибиотики-аплозмомицины, ингибирующие рост грамположительных бактерий Staphylococcusaureus, Bucillussubtilis и Bacillusanthracis.

Мадуралид, выделенный из актинобактерии, проявляет слабую активность к Bucillussubtilis.

МакролидхалкомицинВпроявляетактивностькB. subtilis, staphylococcusaureus, Escherichiacoli, Candidaalbicans.

Новый антибиотик виценистатин был получен из бактерии Streptomycessp. Также был выделен бонактин- вещество ингибирующее рост грамположительных, грамотрицательных бактерий и дрожжей. Американскими исследователями, работавшими по программе поиска продуцентов антибактериальных соединений, среди морских микроорганизмов, получена серия антибиотиков с высокой антимикробной активностью к бактериям родов Staphylococcus и Enterococcus.

Новые хинон-содержащие метаболиты, халаваноны были выделены из Streptomycessp. Фракция содержащая халаваноны ингибирует рост культур Bacullussubtilis, Staphylococcusaureus, Escherichiacoli.Было установлено что антибиотики высоко активны к грамположительным, и менее активны к грамотрицательным бактериям, мицелиальным грибам и дрожжам.

Цитотоксический хиноциклиновый антибиотик козиностатин был выделен из культуральной жидкости актиномицета Micromonosporasp. Антибиотик ингибирует рост грамположительных бактерий и малоактивен по отношению к грамотрицательным бактериям и дрожжам. Соединение высоко активно по отношению к опухолевым клеткам.

Новые антрациклиновые антибиотики гималомицины были получены из Streptomycessp. Эти вещества ингибируют рост грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Циклический дипептид, выделенный из Micromonosporasp.,ингибирует рост Saccharomycescerevisiae и не активен по отношению к Staphylococcusaureusи E. сoli.

Алкалоид феназин ингибирует рост бактерий. Эндофеназины обладают фунгицидной и гербицидной активностью и подавляют рост грамположительных бактерий.

Группой японских ученых были выделены β-лактамные антибиотики из морской бактерии рода Nocardia. Соединения активны к бактериям родов Pseudomonas и Proteus.

антибиотик устойчивых грамположительных бактерий.

Кохакамид А ингибирует рост грамположительных бактерий, обладает фунгицидной активностью и ингибирует рост микроводорослей.

Гетингимицин ингибирует рост грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Три новых антибиотика хандрамицины А,В,С были получены из культуральной жидкости бактерии Actinomadurasp.

Антибиотик корормицин, выделенный из Pseudoalteromonassp., ингибирует рост морских грамотрицательных бактерий и не активен в отношении наземных микроорганизмов.

6.7. Продуценты других биологически активных соединений

Описаны морские бактерии, продуцирующие липиды( Alcaligenessp.,Vibrioparahaemolyticus) экзополисахариды ( Alcaligenessp., Hyphomonassp., Shewanellacolwelliana) липополисахариды (Vibrioangillarium) а так же витамины, эмульгаторы, сульфатированные полисахариды, продуценты поверхностно активных соединений, ароматические кислоты, изопреноидные хиноны, и в частности убихиноны( высокая биологическая активность этих соединений позволяет использовать их в качестве антиоксидантов) Сидерофоры- соединения, осуществляющие транспорт железа. Сидерофоры делают опухолевые клетки восприимчивыми к цитолитическому действию макрофагов.

БылвыделенштаммSterptomyces sp., продуцирующийновыеалкалоидныеэфиры: феназин1 показывалактивностьпротивHaemophilusinfluenzae, Clostridiumperfringers;Феназин 2 имелболееширокийспекторантимикробногодействия, таккакпоказывалактивностьпротивE. Coli, Salmonellaenteriditis, Clostridiumperfringers.

БактерииMicrococcussp. Продуцировали бензтиазолы.

У актинобактерий были обнаружены макроциклические лактоны(макролиды) и лактон-содержащие соединения.

Гидрокси-бутанолидывыступают в роли сигнальных соединений выполняя функцию регуляции синтеза вторичных метаболитов. Эти соединения были получены из штамма Streptomycesvirginiae.Ломаивитицины – мощные ДНК-разрушающие компоненты.

Салинамиды- ингибирующие бактериальную РНК-полимеразу. Подавляют рост грамположительных и грамотрицательных бактерий

Псевдоальтеромонады были первыми морскими бактериями, у которых были обнаружены высокобромированные метаболиты.

Серия С16 ароматических кислот проявляющих спазмолитическую активность была выделена из бактерии Alteromonasrubra.

6.8.Симбиоз бактерийпродуцентов биологически активных веществ и морских гидробионтов

В последние годы все чаще приходят сообщения о случаях симбиоза бактерий с морскими макрогидробионтами. Вследствие такой тесной связи возможны синтрофия, метабиоз и обмен сигнальными веществами в морских сообществах. Известно множество случаев экто- и эндосимбиоза бактерий и морских живтных. В таком случае возникает множество вопросов о том, ктоявляется истинным продуцентом БАВ, макробионты или ассоциированные с ними микроорганизмы.(Elyakov G.B., Kuznetsova,1991)

Некоторые бактерии, ассоциированные с губками, являются продуцентами каротиноидных пигментов. Из вида губок Halichondriaokadai была выделена бактерия Alteromonassp., синтезирующая альтерамид А, который показывал цитотоксическую активность против клеток лейкимии, эпидермальной карциномы(Федосов Ю.В,1988).Другой штамм актиномицета – Streptomycessp. Был выделен группой В. Феникала с поверхности горгонарииPacifigorgiasp. Актиномицет синтезировал серию не описаных ранее метаболитов с цитотоксическими и антибиотическими свойствами. С поверхности неидентифицированной медузы был выбелен Streptomycessp. Продуцирующий новые бициклические пептиды-депсипептиды с высокой антибиотической активностью (салинамиды). СалинамидВ- единственный хлоросодержащий метаболит, выделенный из морских актинобактерий.

Массетолиды и вискозин были метаболитами двух псевдомонад, ассоциированных с красными водорослями.

Антибиотик-продуцирующие бактерии полученые из мадагаскарской губки Dendrillasp. Два из них (Bacilluspumilus Д-7 и Д-12) интересны тем, что синтезировали высокоактивные антибиотики, подавляющие в низких концентрациях развитие патогенных для растений микроорганизмов. Антибиотический препарат из Bacilluspumilus показывал также антидепрессорную активность.

Большое количество (30 - 50%) продуцентов иммунотропных соединений обнаружено в ассоциативных комплексах альционарий, асцидий, ракообразных, но их гораздо меньше в микрофлоре губок и морской воды.

Таким образом было установлено что известные метаболиты морских рыб, моллюсков и других животных и водных растений на самом деле синтезируются симбионтными с ними бактериями.

Приведенные в литературном обзоре данные показывают химическое разнообразие метаболитов морских микроорганизмов, многие из которых не имеют аналогов среди метаболитов наземных бактерий.

.

.

Глава 7. Выделение метаболитов

Метод Тирранен Л.С.

Для качественной оценки действия летучих биологически активных веществ, продуцируемых сапрофитной микрофлорой, на рост патогенных бактерий использовали метод, предложенный Л.С. Тирранен(1989) .Для этого с косячков агара с испытуемыми культурами сапрофитных микроорганизмов, обсеменяющих продукты, делается смыв. Полученной суспензией засеваются чашки Петри со средой “газоном”. Затем, бактериальными дисками, смоченными смывом, делаются реплики на поверхность незасеянной среды, разлитой мерно на дно второй половины чашки Петри, так как разное количество среды в чашках может исказить полученные результаты. Одну половину чашки Петри с газоном испытуемой культуры закрывают другой половиной со свеженанесенными методом реплик тест-культурами и инкубируют в термостате при 20°С.(Тирранен Л.С.,1989). Рост тест-организмов зависел от действия летучих метаболитов, сапрофиты которые продуцировала испытуемая культура, выросшая на противоположной стороне чашки.

А) Б)

В)

Рисунок 1- Определение активности летучих метаболитов (по Л. С. Тирра-нен, 1980): А) пример роста штаммов бактерий; Б) посев сапрофита газоном; В) скрепленные чашки

Газожидкостная хроматография

В последние годы установлено, что анаэробные микроорганизмы в процессе метаболизма продуцируют в среду роста или в патологически измененные ткани летучие жирные кислоты — пропионовую, масляную, изомасляную, валериановую, изовалериановую и др., в то время как аэробные микроорганизмы подобных соединений не образуют

Указанные летучие метаболиты могут быть обнаружены с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ), анализ в течение 1 ч позволяет получить ответ о наличии анаэробов.

Культуру бактерий выращивают вначале на агаризованной среде в пробирках, затем — на жидкой среде в колбах, инокуляторах и посевных аппаратах, а затем в головных (основных) ферментаторах.Следовательно, кроме обеспечения тест-организмов питательными веществами им необходимы более или менее постоянные условия функционирования в заданном направлении (накопление биомассы или метаболитов), в частности, стабильность температуры, снабжение или, напротив, исключение кислорода.

Способ изучения межмикробных взаимодействий(патент РФ № 2376381)

Способ предусматривает следующее. Из исследуемой культуры микроорганизмов получают клеточные компоненты, представляющие собой экзометаболиты, клеточный экстракт и клеточные стенки.Для получения экзометаболитов суточные бульонные культуры M.luteus и C.minutissimum центрифугировали при 3000 об/мин 15 минут, отбирали супернатанты, обеззараживали их хлороформом 20 минут (на 3 мл супернатанта - 0,1 мл хлороформа), центрифугировали при 3000 об/мин 15 минут и снова отбирали супернатанты. Полученные клеточные компоненты обеззараживают хлороформом из расчета 0,1 мл хлороформа на 3 мл клеточных компонентов. Затем смешивают каждый из выделенных клеточных компонентов со штаммом-антагонистом в соотношении 1:2 соответственно. Параллельно готовят две контрольные пробы, при этом контроль 1 готовят из жидкой питательной среды и физиологического раствора, а контроль 2 - из жидкой питательной среды и штамма-антагониста. После чего опытные и контрольные пробы инкубируют. После этого разбавляют жидкой питательной средой, инкубируют и отделяют супернатанты центрифугированием. Полученные супернатанты обеззараживают путем обработки их хлороформом из расчета 0,1 мл хлороформа на 3 мл сутпертатанта. Обеззараженныесупернатанты смешивают с взвесью индикаторного штамма в соотношении 1:2 соответственно. Инкубируют и разбавляют жидкой питательной средой. После чего высевают индикаторный штамм на плотную питательную среду и культивируют. Затем подсчитывают КОЕ в опытных и контрольных пробах. Рассчитывают антагонистическую активность штамма-антагониста и по изменению антагонистической активности в опытных пробах по сравнению с контролем судят о способности исследуемой культуры микроорганизмов регулировать антагонистическую активность бактерий.

Метод осаждения целевого продукта

Наиболее простым методом, часто применяемым для выделения метаболитов является метод осаждения целевого продукта. Многие вещества имеют так называемую изоэлектрическую точку, т.е. область значений рН среды, в которых их растворимость минимальна. Поэтому, установив значение рН нативного раствора на требуемом уровне, можно получить осадок выделяемого вещества, тогда как примеси остаются в растворе. Технологии, использующие метод осаждения, достаточно широко применяются в биотехнологии. По этому способу выделяют ряд первичных метаболитов: аминокислоты, L-глутаминовую и L-валин. антибиотик 7-хлортетрациклин медицинского назначения.

Метод,основанный на баромембранных процессах

Другая группа методов выделения метаболитов основывается на применении баромембранных процессов: обратного осмоса, микро- и ультрафильтрации. Последние два широко используются в биотехнологии. Метод микрофильтрации нашел широкое применение при отделении взвешанных частиц и стерилизации жидких потоков. Его несомненное достоинство состоит в том, что он позволяет достаточно надежно освобождать нативные растворы от посторонней микрофлоры и получать достаточно прозрачные растворы. Метод ультрафильтрации применяют для отделения,очистки и концентрирования соединений с молекулярными массами не ниже 5000 Д. К их числу относятся белковые соединения, в том числе ферменты, высокомолекулярные компоненты нуклеиновых кислот и углеводов. Оказалось весьма перспективным использовать метод ультрафильтрации для очистки нативных растворов от нежелательных окрашенных продуктов ферментации. Около 50% пигментных веществ остается в концентрате (ретанте). Это позволило частично или полностью исключить стадии очистки растворов метаболитов, основанные на использовании ионообменных технологий и активированного угля.

Выводы

1. Множество таксонов микроорганизмов являются обитателями океанов ( кластеры Proteobacteria, Cytophaga- Flavobacterium- Bateroides- Fleibacter, Actinobacteria, а также фирмикуты)

2. Морфологические и физико-биохимические признаки и свойства морских микроорганизмов обусловлены специфическими факторами среды.

3. Морские микроорганизмы способны синтезировать разнообразные метаболиты

4. Наиболее распространенными являются цитотоксические и антимикробные соединения

5. Особенностью морских микроорганизмов является наличие гидролитических ферментов

6. Многие физиологически активные соединения синтезируются микробными симбионтами

7. Практически все микробные метаболиты активны и могут выступать как ингибиторы или стимуляторы развития отдельных групп микроорганизмов

8. Образование метаболитов происходит упорядоченно и в определенные стадии

9. Высокий уровень метаболизма морских бактерий ,наличие мультиферментных систем, избирательность по отношению к отдельным элементам приводит к накоплению минеральных отложений в океане

10. Метаболиты морских прокариот могут быть использованы в области медицины, промышленности, сельском хозяйстве и др. как продуценты различных полезных веществ

11. По данным литературных источников изучение морских физиологически активных веществ происходит не так давно и результаты исследований свидетельствуют о перспективности поиска продуцентов метаболитов.

Список литературы

1.Вахитов Т.Я., Момот Е.Н., Толпаров Ю.Н. Динамика и функции экзометаболитов в процессе роста периодической культуры Escherichiacoli M-17 // Журнал микробиологии. 2005. № 1. С. 16-21.

2.Вахитов Т.Я., Петров Л.Н. Регуляторные функции экзометаболитов бактерий

3.Микробиология. 2006. Т. 75. № 4. С. 483.

4.Волков М.Ю., Ткаченко Е.И., Воробейников Е.В., Синица А.В. Метаболиты Bacillussubtilis как новые перспективные пробиотические препараты // 5.Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2007. № 2. С. 75-80.

6.Сидоренко М.Л., Бузолева Л.С. Влияние летучих метаболитов прорастающих семян на размножение бактерий Listeriamonocytogenes и Yersiniapseudotuberculosis // Прикладная биохимия и микробиология. 2012. Т. 48. № 3. С. 308-312.

7.Тамбиев А.Х., Телитченко М.М. Роль летучих и водорастворимых биологически активных соединений биогенного происхождения. М.: Изд-во МГУ, 1971. 152 c.

8.Терехова В.Е., Айздайчер Н.А., Бузолёва Л.С., Сомов Г.П. Влияние метаболитов морских микроводорослей на размножение бактерий вида Listeriamonocytogenes // Биология моря. 2009. Т. 35. № 4. С. 306-309.

9.Тирранен Л.С. Роль летучих метаболитов в межмикробном взаимодействии. Новосибирск: Наука, 1989. 104 с.

10.Тирранен Л.С., Ковров Б.Г., Черепанов О.А. Характер взаимодействия микроорганизмов через их газообразные метаболиты // Микробиология. 1980. Т. 49. № 5. C. 788-793.

11. Baam R.B., Gandhi N.M., Freitas Y.M.Antibiotic activity of marine micro-organisms. // HelgolanderWissenschaft. Meeresuntersuch., 1966, v. 13, p. 181-187.

12.Baam R.B., Gandhi N.M., Freitas Y.M. Antibiotic activity of marine micro-organisms: the antibacterial spectrum. // HelgolanderWissenschaft. Meeresuntersuch., 1966, v. 13, p. 188-191.

13. De Giaxa J. Ueber das VerhalteneinigerpathogenerMikroorganismen in Meerwasser. // Z. Hyg., 1889, B. 6., S. 162-225.

14. Elyakov G.B., Kuznetsova T.A., Mikhailov V.V., Maltsev I.I., Voinov V.G., Fedoreyev S.A. Brominated diphenyl ethers from a marine bacterium associated with the sponge Dysidea sp. // Experientia, 1991, v. 47, p. 632-633.

15. Okami Y. The search for bioactive metabolites from marine bacteria. // J. Mar. Biotechn., 1993, v. 1, p. 59-65.

16. ZoBell C.E. Marine Microbiology. // ChronicaBotanica Company, Waltham, USA, 1946, 240 p.

17. ZoBell C.E., Upham H.C. A list of marine bacteria including descriptions of sixty new species. // Bull. Scripps Inst. Oceanogr. Univ. Calif. Tech. Ser., 1944, v. 5, p. 239-292.

18.ЕляковГ.Б., СтоникВ.А. Терпенсидыморскихорганизмов. М.: Наука, 1986.

19.Федосов Ю.В., Михайлов В.В., Плисова Е.Ю. и др. II Биосинтез ферментов микроорганизмами / Ред. Халмурадов А.Г., Безбородое A.M. Ташкент: Фан, 1988. С. 155 -156.

20.Вахитов Т.Я., Добролеж О.В., Петров JI.H. и др. Сравнительное изучение действия препаратов аутостимуляторов роста Escherichiacoli М-17 и фруктоолигосахаридов на рост и антагонистичекую активность лактобацилл // Журн. микробиол. 2001- №3.- С. 80-83.

21. Вахитов Т.Я., Момот Е.Н., Толпаров Ю.Н. Динамика и функции экзометаболитов в процессе роста периодической культуры Escherichiacoli М-17 // Журн. микробиол 2005а - № 1- С. 16-21.

22.Вахитов Т.Я., Момот Е.Н., Шалаева О.Н., Петров J1.H. Экзометаболитыпробиотиков как фактор восстановления микробиоценоза человека // Цитокины. Воспаление. Иммунитет: Материалы междунар. на-учно-практич. школы-конф СПб, 2002. - С.24.

23. Вахитов Т.Я., Момот Е.Н., Шалаева О.Н., Петров J1.H. Состав и биологическая активность экзометаболитовEscherichiacoli М-17 // Журн. микробиол 2003-№6-С.20-25.

24. Вахитов Т.Я., Ососкова Л.И., Яшина О.Ю., Морозова Э.Н., Куликов С.В. Ауторегуляторы развития бактериальных популяций //

25. Вахитов Т.Я., Петров JI.H. Регуляторные функции экзометаболитов бактерий // Микробиология,- 2006 Т.75.- №4 - С.483-488.

26.Дебабов В.Г. Метаболическая инженерия микробной клетки // Микробиология.- 1999 Т.68 - Вып.6 - С.823-833.

27.Maltsev I.I., Stonik VA., KalinovskyА.1., Elyakov G.B. //Biochem. Physiol. 1984. V. 78B. No. 2. P. 421 - 426.

28.Федосов Ю.В., Михайлов В.В., Плисова Е.Ю. и др. II Биосинтез ферментов микроорганизмами / Ред. Халмурадов А.Г., Безбородое A.M. Ташкент: Фан, 1988. С. 155 -156.

29.Nakamura., Iitaka H., KitaharaТ., Okazaki T. II J. Ant. 1977. V. 30. P. 714 - 717.

30.SatoК., Okazaki Т., Maeda К., OkamiY.ll J. Ant. 1978. V. 31. P. 632-635.

31.Okami Y., Hotta K. // J. Ant. 1979. V. 32. P. 964 - 966.

32.Kamei Y., Yoshimizu M., Ezura Y., Kimura T. // Nippon Suisan Gakkaishi. 1987. V. 53. P. 2179 - 2185.

33.Kabori H., Sullivan C.W., Shizuya H. II Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 6691 - 6695.

34.Van Qua D., Simidu U., Taga N. // Can. J. Microbiol. 1981.V.27.P.505-510.

35.Федосов Ю.В., Михайлов В.В., Плисова Е.Ю. и др. //Биологически активные вещества гидробионтов при комплексной утилизации ресурсов океана / Ред. Эпштейн Л.М. и др. Владивосток: ТИНРО, 1988. С. 19 - 20.

36. Еляков Г.Б., Стоник В.А. Терпеноиды морских микроорганизмов. М.:Наука, 1986. 227 с.

37.Семенов А.В. Характеристика антагонистической активности Staphylococcusaureus при межмикробных взаимодействиях. Вестник Томского государственного университета. Биология. 2011. № 3. С. 56-66.

38. Федосов Ю.В., Михайлов В.В., Плисова Е.Ю. и др. //Биологически активные вещества гидробионтов при комплексной утилизации ресурсов океана / Ред. Эпштейн Л.М. и др. Владивосток: ТИНРО, 1988. С. 19 - 20.

39. Федосов Ю.В., Михайлов В.В., Плисова Е.Ю. и др. II Биосинтез ферментов микроорганизмами / Ред. Халмурадов А.Г., Безбородое A.M. Ташкент: Фан, 1988. С. 155 -156.

40.Ю. А. Израиль. Антропогенная экология океана. Стр. 459

41.Барбье М. Введение в химическую экологию М.: Мир, 1978 - 229 с.

42.Безбородов А. М. Биохимические основы микробиологического синтеза М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984 - 394 с.

43.Актуальные проблемы биотехнологии: Материалы 1 Отраслевой конф. молодых ученых- Кольцово, 1988-М.: 1989.-С.27-28.

44.Герхардт Ф. и др. Методы общей бактериологии М.: Мир, 1983-Т.1.-536 с

45.Громов Б.В., Павленко Г.В. Экология бактерий Л.: ЛГУ, 1989 - 248 с.

46. Иванов В.Н. Экзо- и эндотрофия клетки- Киев: Наукова думка, 1990.- 104

47.Кировская Т.А. Исследования популяционной организации и межклеточной коммуникации у микроорганизмов в Советском Союзе (России) второй половины XX века: историко-научный анализ: Дисс. канд. биол. наук: 07.00.10 / ИИЕТ РАН.- М., 2005.- 188 с.

48.Tresner H, Weyland N. Differential tolerance of Sterptomycetes to NaCl as a taxanomic aid Microbiol.,1968, с.1134-1136

49.Волков М.Ю., Ткаченко Е.И., Метаболиты Bacillussubtillisкак новые перспективные пробиотические препараты ,Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 2007г.,с 75-80

Код для цитирования: Скопировать