VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014

В настоящее время накоплено большое количество фактов, свидетельствующих о принципиальной возможности сапротрофного существования патогенных микроорганизмов в объектах окружающей среды (Ганнушкин, 1952; Терских, 1958; Беляков, 1964; Головачева, 1978; Сомов, 1974, 1978, 1985). Особый интерес в этом плане вызывают возбудители инфекционных болезней, которые длительно выживают в почве, воде, растительных субстратах и для которых утвердился термин сапрозоонозы (Сомов, Литвин, 1988). Listeriamonocytogenes – возбудитель листериоза довольно часто выделяют из растений.

Можно представить целый ряд растений, которые являются факторами передачи возбудителей инфекций. Например, Yersiniapseudotuberculosis способны обитать на капусте белокочанной, попадая на растение с экскрементами мышевидных грызунов, прикрепляясь к поверхности листа за счёт лектинов (Андреюк, 1992). Человек, употребляя в пищу инфицированную капусту, подвергается риску заболевания. Такими же переносчиками Yersiniapseudotuberculosis могут быть в основном корнеплоды: редис, лук, морковь, свекла. Механизм передачи возбудителей один - через мышевидных грызунов. У корнеплодов патогенные микроорганизмы не закрепляются с помощью лектинов, заражение человека и животных происходит в результате нарушения санитарно-гигиенических норм, с зараженной почвой (Бакулов, 1991; Зенова, 1986). Помимо корнеплодов, определенный интерес представляют и зеленые растения. Так к факторам передачи Listeriamonocytogenes относят кукурузу (листья), салат (Бакулов, 1991; Беляков, 1994).

Чаще всего в литературе встречаются данные по выделению Listeriamonocetogenes из листьев салата (Казаков, 1993). Является ли салат просто звеном в цепи передачи инфекционного агента (мышевидные грызуны – салат – человек), либо способен оказывать влияние на биологические свойства возбудителя – эти вопросы не освещены в литературе. Известно, что растение может стимулировать рост микроорганизмов, контактирующих с ним, выступая в роли субстрата (Кожевин, 1989; Красильников, 1958), а возможно и опосредованно, через метаболиты эпифитной микрофлоры, населяющей поверхность листовой пластины (Ларионов, 1988).

Поэтому цель настоящей работы – исследовать влияние различных сортов салата и сапротрофной микрофлоры, населяющей поверхность листа салата, на рост и размножение Listeriamonocitogenes.

Для достижения поставленной цели были поставлены и последовательно решались следующие задачи:

1. Исследовать влияниеразных сортов листового салатана рост и размножение Listeriamonocytogenes;

2. Изучить влияние различных сортов и частей листового салата на рост и размножение Listeriamonocytogenes;

3. Провести скрининговые исследования поиска штаммов сапротрофных микроорганизмов, контаминирующих поверхность листового салата, оказывающих стимулирующее действие на рост различных штаммов Listeriamonocуtogenes;

4. Изучить влияние экзометаболитов сапротрофных микроорганизмов, выделенных с поверхности салата: Эндивий Нежный, Лоло – росса, Кучерявец Одесский, Рукола, Корн, на динамику роста различных штаммов Listeriamonocуtogenes;

Термины, определения и сокращения

В настоящей письменной работе применены следующие термины с соответствующими определениями:

Алкалоиды - группа азотсодержащих циклических соединений (растительного происхождения). Алкалоиды различаются по азотистому основанию или в зависимости от источника выделения.

Каротины — это жиросодержащие пигменты.

Лактуцин – алкалоид, содержащийся в млечном соке. Основание лактуковой кислоты.

Лектины (от лат. legere — собирать) — белки и гликопротеины, обладающие способностью высокоспецифично связывать остатки углеводов на поверхности клеток, в частности, вызывая их агглютинацию.

Листериоз- это инфекционное заболевание вызывается бациллой с названием листерия.

Лутрасил – нетканый синтетический материал из полипропиленового волокна. Основное назначение лутрасила – защита растений от неблагоприятных погодных условий – ранних и возвратных заморозков и возможность получения ранней продукции.

Психрофилы - (криофилы), организмы, нормально существующие и размножающиеся при относительно низких температурах (обычно не выше 10 °C).

Раствор Патерсона – Кука: Na₂HPO_4, КН₂РО₄

Сапротрофы - (от греч. saprds — гнилой и trophe — пища, питание), организмы, использующие в качестве источников питания мёртвые органические субстраты.

Серовар (серотип) – группа микроорганизмов одного вида, объединяемые общей антигенной структурой, определяемой серологическими методами диагностики.

Сорт - группа культурных растений, полученная в результате селекции в рамках низшего из известных ботанических таксонов и обладающая определённым набором характеристик (полезных или декоративных), который отличает эту группу растений от других растений того же вида.

Среда ГРМ: панкреатический гидролизат рыбной муки, пептон ферментативный, натрия хлорид, агар микробиологический.

Среда Ишемицу – Кимура (ИК): агар, СаСО3, МgSO4, пептон, дрожжевой экстракт, K₂HPO₄, глюкоза, NaCl, MgCl₂ CaCl₂ KCl FeSO₄, вода дистиллированная.

Суспензия – смесь веществ, где твёрдое вещество распределено в виде мельчайших частичек в жидком веществе во взвешенном состоянии.

Факторы передачи — элементы внешней среды, обеспечивающие передачу возбудителей инфекционных болезней.

Хемоорганогетеротрофы - микроорганизмы получающие энергию за счёт окисления различных органических соединений в дыхательной цепи.

Цветушность (стеблевание) — нарушение двулетнего цикла развития растений у моркови, свеклы, капусты, редьки и других культур и появление однолетних форм.

Глава 1 Обзор литературы

1.  

   1. Ботаническая характеристика культуры салата

Название культуры произошло от латинского слова «лактук», то есть «молоко», потому что салат содержит млечный сок, придающий ему горьковатый вкус. Родоначальником этой культуры считают латук компасный (Lactucaserriola), в диком виде растущий в Западной и Южной Европе, Азии и Северной Африке (Бексеев, 1974; Большунов, 1971; Звягинцев, 1973). В Европу он попал в середине XVI века, а сегодня, благодаря высоким вкусовым качествам, его выращивают на всех континентах земного шара.

В России слово «салат» имеет двойное значение: название растения и блюда, поскольку первоначально салаты готовили только из этого растения.

Салат посевной представляет собой однолетнее растение из семейства сложноцветных. Растение имеет невысокий ветвистый стебель, с округлыми листьями, которые употребляются в пищу. Выращивается это неприхотливое растение на участках многих огородников, оно не требует особого ухода и заботы (Кожевин, 1989; Красильников, 1958). Листья салата при правильном приготовлении вкусны и полезны, их лечебные свойства используются при лечении некоторых заболеваний.

Прикорневые листья салата сидячие, простые, большей частью цельные, разнообразной формы и окраски (Рисунок 1). Поверхность пластинки листа гладкая, пузырчатая или складчато-морщинистая, гофрированная или курчавая. Корень у салата всех разновидностей стержневого типа, значительно утолщенный в верхней части, имеет большое количество боковых отвлетвлений, распологающихся близко к поверхности почвы (Гаенко, 1971; Бурова, 1974, Брызгалов, 1972; Большунов, 1971).Через 30–70 дней после посева растение образует цветочный стебель высотой до одного метра.

Р и с у н о к 1 - Внешний вид листового салата

Cоцветие – корзинка состоит из обоеполых язычковых цветков желтого или желто-зеленого цвета (Рисунок 2). Язычковые, светло-жёлтые с хохолком цветки образуют корзинку 2-4 мм в диаметре. В каждой корзинке - от 8 до 12 цветков.

Р и с у н о к 2 - Листовой салат в период цветения

Несколько таких корзинок на самом верху растения собраны в пирамидальные метёлки. Семена плоские, вытянутые (Рисунок 3). Семянки в зависимости от сорта имеют серебристо-серую, желтую или коричневую окраску, мелкие в 1 гр их насчитывается около 1000 штук. Корни, стебли и листья на изломе выделяют несвёртывающийся млечный сок.

Р и с у н о к 3 - Внешний вид семян листового салата

Салат благодаря своему биохимическому составу занимает особое место среди овощей. В его листьях имеются почти все известные витамины, а также органические кислоты, соли калия, кальция, железа, марганца, кобальт, медь, йод, цинк, марганец, молибден, бор, каротин, витамины С, B1, B2, Е, К, РР, фолиевая кислота. По содержанию солей кальция салат занимает пеpвое место среди овощей, по содержанию железа – тpетье место после шпината и шнитт-лука, а по содержанию магния уступает лишь гороху и кольpаби. В свежих листьях салата 0,6-6,0% бета-каротина, 65% яблочной, 48% лимонной, 11% щавелевой кислот.

Латук содержит алкалоиды, смолы, горечи.Млечный сок листьев салата содержит – лактуцин, лактуцерин, лактуциктин, алкалоиды и другие вещества(Алборишвили , 1971; Алиев , 1971; Богоев, 1982).

Выделяют 4 разновидности салата (Рисунок 4).

Р и с у н о к 4 - Разновидности салата

Листовой салат. Листья могут быть яйцевидные, обратнояйцевидные, широкообратно-яйцевидные или веерообразные. Край листа цельнокрайний, рассеченный на доли, зубчатый, волнистый (Рисунок 5).

Р и с у н о к5 - Внешний вид листового салата

Полукочанный (рыхлокочанный) салат. Образует мощную и приподнятую листовую розетку (Рисунок 6).

Р и с у н о к 6 - Внешний вид полукочанного салата

Салат ромэн. Листья удлиненно-обратнояйцевидные, довольно плотные, кожистые, образуют кочаны удлиненно - овальной формы (Рисунок 7). Этот салат наиболее холодостоек, может переносить кратковременные понижения температуры до 5 °С.

Р и с у н о к 7 - Внешний вид салата ромэн

Кочанный (плотнокочанный) салат. Листья округлой, почковидной, овальной или веерообразной формы с ровными или зубчатыми краями, образуют в центре розетки кочаны различной плотности. Форма кочана округлая, округло-плоская или короткоовальная (Рисунок 8).

Р и с у н о к 8 - Внешний вид качанного салата

Из разновидностей культурного салата наибольшее распространение в стране получил салат листовой (Lactuca sativa). Эта разновидность, как и весь вид, является весьма полиморфной. Отличительной особенностью возделываемых сортов является то, что растения собраны в лежачую, полуприподнятую или прямо вверх направленную розетку. Пластинка листа цельная или в разной степени рассеченная, с гладким цельным или зубчато - надрезанным и курчавым краем. Форма и величина листовой пластинки очень разнообразны, как и окраска листьев, изменяющаяся от светло до темно- зеленой с различными оттенками (серо - желто зеленая, с красновато - бурой или коричневой пигментацией). В пределах каждой разновидности выделены сортотипы, объединяющие сорта с близкими морфологическими признаками (Анасимова, 1968; Большунов, 1971; Бурова, 1974; Ващенко, 1963). Ценность салата в том, что он используется в пищу, как правило, только в сыром виде, поэтому все питательные вещества, содержащиеся в нем, полностью сохраняются.

1. 2 Хозяйственно - биологические свойства листового салата

В практике садоводства распространены особо широко три разновидности салата: листовой, который образует только розетку листьев, кочанный – образующий кроме листьев кочан, салат “ромен” – более позднеспелая разновидность, имеющая листья удлиненной яйцевидной формы, которые образуют кочан такой же удлиненной формы.

Ценность салата в том, что он используется в пищу, как правило, только в сыром виде, поэтому все питательные вещества, содержащиеся в нем, полностью сохраняются. Салат повышает аппетит и улучшает пищеварение. Салат - ценный естественный витаминоноситель. В листьях содержатся витамины С и каротин. Даже небольшое количество (30 граммов) свежих листьев салата покрывает среднесуточную потребность человека в витамине А. В листьях также содержится и особое вещество – лактурин, которое придаёт им горьковатый привкус. Оно действует успокаивающе, улучшает сон и снижает кровяное давление. Есть в нем витамины В, К, Е, Р, фолиевая кислота. Салат не только обогащает наш рацион витаминами и микроэлементами, но и регламентирует водный баланс в организме (Алборишвили , 1971; Алиев , 1971; Богоев, 1982). Он оказывает освежающее действие и стимулирует пищеварение. Во втором веке нашей эры римский врач Гален писал, что спал крепко только тогда, когда на ночь съедал порцию салата.

Салат – холодостойкое растение. Семена его прорастают при температуре 5–10 градусов. Наиболее благоприятные условия для роста и развития растения – умеренная температура в пределах 15-20 градусов тепла в сочетании с достаточной влажностью воздуха и почвы. В прохладные и влажные годы растения формируют хорошо развитую розетку нежных, долго не грубеющих листьев и гораздо позднее стрелкуются. Наоборот, в сухое и жаркое лето качество салата снижается из-за ускоренного появления цветочных стеблей. Салат очень требователен к почве, поэтому высокие урожаи даёт на лёгких высокоплодородных почвах (Ващенко, 1975; Гаенко, 1971).

Почва должна быть богатой гумусом и не кислой, в течение всего периода роста салата ее нужно поддерживать во влажном состоянии.

Среднеспелые и поздние сорта высевают на солнечном или слегка притененном участке. Почву готовят с осени, при перекопке вносят садовый компост. Незадолго до посева поверхность почвы разбивают граблями до получения мелкокомковатой структуры и вносят комплексное минеральное удобрение. На участках, зараженных почвенными вредителями, вносят пиримифосметил.

В районах с теплым климатом ранние сорта можно высевать сразу в открытый грунт на солнечное, защищенное от ветра место с хорошо дренированной почвой.

Под салат выбирают участки, рано освобождающиеся от снега, с лёгкой высокоплодородной почвой или тщательно удобренной. Желательно высевать салат пораньше весной одновременно с морковью, так как при поздних посевах в пересушенную почву появление всходов может задержаться до 15-20 дней, если не будет обильного полива. Учитывая скороспелость этого растения, посевы в течение лета следует повторять с таким расчетом, чтобы салат можно было собирать до самой поздней осени. Участок под эту культуру разбивают на грядки (Рисунок 9), которые засевают постепенно, через каждые 10-15 дней. Листовой салат высевают трех – четырехстрочными лентами с расстоянием 1-20 сантиметров между строчками и до полуметра между лентами. Для сортов кочанного салата расстояние между строчками должно быть больше – до 30 сантиметров.

Р и с у н о к 9 - Участок почвы для посева

Уход за салатом заключается в поддержании почвы в рыхлом состоянии и чистой от сорняков, а также в проведении обильных поливов. При густых всходах их прореживают в фазе образования розетки листьев, оставляя расстояние между растениями у листовых сортов 8-10 см, у кочанных немного больше – 12-15 см, а у “ромен” до 25 см. Выдернутые в эту фазу растения уже можно использовать в пищу. Поливы обязательны после каждого прореживания, ну и в засушливые периоды – обязательно. Иначе при недостатке влаги у растений быстро начинается стеблевание, что заметно ухудшает вкусовые качества салата.

Салат – скороспелая культура. Спелость наступает уже через месяц-полтора после посева. Убирают урожай салата в несколько приёмов. Вначале выбирают более крупные растения, а остальные оставляют “дорастать”. Максимальный размер салат достигает перед образованием цветочных стеблей. В это время желательно успеть убрать весь урожай, не оставляя ничего (Алборишвили, 1971; Алиев, 1971; Бексеев, 1974; Большунов, 1971). Сбор урожая желательно делать в более прохладную часть дня – утром или позже вечером, тогда листья сохранятся дольше свежими и упругими. В теплом помещении сорванные листья быстро вянут, но если после уборки урожай охладить, то в охлаждённом состоянии он может храниться до 10 дней и более. Для того чтобы салат на столе стоял всю осень и первую половину зимы, делают летние посевы салата “ромен” в середине июля. В начале октября растение убирают и, если есть возможность, переносят в подвал или в теплый сарай, где прикапывают в грунт или емкость с землёй, и уже оттуда по мере необходимости расходуют.

1. 3 Сорта листового салата

Семейство: Asteraceae – Астровые

Вид: LactucasativaL.

Сорт: Лоло – росса, Кучерявец Одесский, Эндивий Нежный.

Лоло - росса – один из многочисленных видов листового салата. Ранне спелый. Салат Лоло - росса относится к знаменитому семейству латуков, полезных диетических зеленых овощных растений. От полных всходов до технической спелости 40 дней. Розетка листьев полупрямостоячая. Листья морщинистые, курчавые, светло-зеленой окраски с широким розовым краем. Масса одного растения 80-100 г. Возделывается как в открытом, так и в защищенном грунте. Урожайность 1,8-2,5 кг/м²

Коралловый салат – второе название этой разновидности листового салата. Лоло - росса получил его благодаря окраске своих листьев. Листья салата очень красивы, поэтому являются популярным украшением любого стола. Лоло - росса – салат с нежно-зелеными кудрявыми листьями, окаймленными ярко-бордовой широкой полосой. Некоторые разновидности этого салата имеют целиком красноватые листья, собранные в розетку (Брызгалов, 1972; Бурова, 1974; Гаенко, 1971).

Лоло - росса – один из самых востребованных видов листового салата в мировой кулинарии. И не только благодаря изумительной окраске листьев (Рисунок 10). Лола - росса содержит наибольшее количество кальция по сравнению с другими видами салатов. Низкая калорийность салата позволяет употреблять его в пищу, не боясь повредить красивой фигуре.

Р и с у н о к 10 - Внешний вид сорта салата Лолло – росса

Кучерявец Одесский - популярный среднепоздний сорт (68-75 дней). Лист светло-зеленый, веерообразный с сильно волнистым краем (Рисунок 11). Консистенция хрустящая, вкус хороший, без горечи. Сорт отличается устойчивостью к цветушности и длительным периодом выхода товарной продукции.

Розетка листьев средняя, диаметром до 35 см, полуприподнятая. Листья веерообразные со свисающим мелкокурчавым краем, светло-зеленые. Урожай до 1-2,7 кг/кв.м. Для открытого и защищенного грунта.

Р и с у н о к 11 - Внешний вид сорта салата Кучерявц Одесский

Эндивий Нежный. Однолетнее растение из семейства астровых. Образует мощную корневую розетку листьев и корнеплод. Листья зеленые, широкие, изрезанные, кудрявые, со слегка горьковатым вкусом (Рисунок 12). Горечь обусловлена содержанием инулина. В пищу употребляются розеточные листья в свежем виде, в виде салатов. Холодостойкий, легко переносит весенние легкие кратковременные заморозки. К срезке листьев можно приступать через 40-60 дней после посева. Оптимальная для прорастания семян температура почвы 14 - 18^оС.

Р и с у н о к 12 - Внешний вид сорта салата Эндивий Нежный

Семейство: Valerianaceae- Валериановые, травянистая. Общее цветоложе к Вид: Valerianella olitoriaи

Сорт: Корн

Салат полевой, валерьяница, Корн (Valerianellaolitoria), семейство Валериановые – листовые сорта (Рисунок 13). Растения высотой 10-40 см с небольшой розеткой листьев. При весеннем посеве можно осенью собрать свои семена (это растение — самоопылитель). Летом полевой салат сеют до середины августа. Растения не гибнут до -15°С, так что с посадок, прикрытых лутрасилом, урожай собирают до ноября и позже. Удается подзимний посев, хорошо растет этот салат в неотапливаемых теплицах.

Растение нетребовательно к плодородию почвы, неплохо выносит сильное затенение. Семена заделывают мелко (1–1,5 см). Летом всходы появляются на 8–10-й день, листья можно срывать через 50–70 дней после всходов, а убирать розетки — через 80–85. В сухое лето без поливов листья грубеют, как и у всех салатов.

Р и с у н о к 13 - Внешний вид салата Корн (Валерьянница)

Семейство: Brassicaceae- Крестоцветные

Вид: Eruca sativa

Сорт:Рукола

Индау (Eruca sativa Lam.), или рукола, эрука, гулявник, аругула, рокет-салат – однолетнее или двулетнее растение семейства капустных (крестоцветных). Вообще-то это сорняк, встречающийся в диком виде от Европы до Дальнего Востока.

Рукола – однолетнее растение семейства капустных. Листья с мелким опушением, похожи на листья редиса (Рисунок 14). Соцветие – небольшая кисть с некрупными белыми или желтоватыми цветками с темно-фиолетовыми жилками. Плод – овально-продолговатый стручок. Рукола довольно скороспелая, влаголюбивая и холодостойкая культура. Молодые растения выносят заморозки до - 6ºС.

Р и с у н о к 14 - Внешний вид Руколы

1. 4 Растения как среда обитания микроорганизмов

Поверхность растения, и главным образом поверхность листьев – филлосфера, является местом обитания разнообразных микроорганизмов, которые определяют как эпифитные (Беляков, 1994; Елкин, 2001; Звягинцев, 1973). Среди эпифитных микроорганизмов преобладают бактерии. На 1 грамм зеленой массы растения может приходиться до 10⁶ – 10⁷ клеток бактерий. Бактерии не только находятся на поверхности листьев, но активно там развиваются. Особенно обильна эпифитная микрофлора на поверхности растений, растущих в условиях влажного климата. Толщина слоя микроорганизмов на листьях таких растений может достигать 20 мкм.

Численность популяций бактерий филлосферы определяется доступностью влаги и питательных веществ, источником которых служат вымываемые водой из листа вещества, секреты и экссудаты растения. Роса и смывы с листьев содержат аминокислоты, углеводы, углеводороды, органические кислоты, фитогормоны, неорганические ионы. В качестве питательных субстратов микробам могут служить также оседающие на поверхности листьев частицы, пыльцы, вещества, растворенные в дождевой воде.

Систематический состав бактерий филлосферы разнообразен. На разных растениях могут преобладать различные виды, но специфичность микрофлоры филлосферы не доказана. Для многих бактерий филлосферы характерна способность к синтезу меланиновых и (или) каратиноидных пигментов, защищающих их клетки от неблагоприятного воздействия солнечной радиации. Обитатели филлосферы часто синтезируют внеклеточные полисахариды, защищающие клетки как от радиации, так и от высыхания. Кроме того, слизи усиливают адгезию клеток, так что даже под проливным дождем бактерии удерживаются на листьях.

Бактерии, развивающиеся в филлосфере, могут приносить растению пользу, выделяя стимуляторы роста; значительная часть этих бактерий способна к азотфиксации. Однако в составе микрофлоры филлосферы могут сохраняться и фитопатогенные формы, до некоторых пор не вызывающие заболевания растения (Громов, Павленко, 1989).

1.5 Экологические особенности сапрозоонозов

Растения являются одной из сред обитания возбудителей сапрозоонозов. С течением времени было накоплено большое количество фактов, свидетельствующих о принципиальной возможности сапрофитного существования патогенных микроорганизмов в объектах окружающей среды. Особый интерес в этом плане вызывают возбудители инфекционных болезней. Для таких инфекций утвердился термин сапрозоонозы. Жизненная программа таких микроорганизмов состоит в непрерывном переходе из окружающей среды в организм теплокровного животного и человека, где они ведут паразитический образ жизни, и возвращении в окружающую среду, где они функционируют как сапрофиты (Сомов, 1974, 1976,; Сомов, Литвин, 1988). Наличие этих двух сред (теплокровный организм и внешняя среда), между которыми происходит регулярный или периодический обмен части популяции, обеспечивает сохранение в природе сапрозоонозного микроорганизма как биологического вида. Таким образом, нельзя не признавать важную роль внешней среды в циркуляции, длительном сохранении и распространении возбудителей сапрозоонозов.

Появляется все больше оснований считать, что эпидемические варианты возбудителей инфекций могут формироваться не только при циркуляции среди людей или теплокровных животных, но и применительно к сапронозам в объектах внешней среды, в частности, на растениях. (Литвин, Пушкарёва, 1994). Так, при заболеваемости листериозом роль овощных культур имеет очень важное эпидемиологическое и эпизоотическое значение (Бакулов, 1991).

По данным В. Г. Кузнецова (1990), регулярно отмечается возрастание инфицированности овощей в процессе хранения, даже при отсутствии грызунов. Опираясь на факты одинаковой инфицированности овощей, как при наличии зараженных грызунов, так и в их отсутствии, автор пришёл к принципиально важному выводу, что грызуны сами заражаются, поедая овощи, инфицированные возбудителем.

Бактериологическое исследование овощей в овощехранилищах показало, что в течение зимнего хранения происходит нарастание обсеменённости овощей и корнеплодов иерсиниозным микробом. При исследовании овощей, только что привезённых с полей, обсеменённость их была в пределах 0,6 – 4,5 проб, а после зимнего хранения достигла 50%, а в некоторых овощах в отдельные годы доходила до 100% (Кузнецов, Раковский и другие, 1975, 1976). Следовательно, в условиях овощехранилищ, при низкой температуре (7 – 8^оС), высокой влажности, отсутствии света на овощах происходит активное размножение и массивное накопление патогенного микроба.

Listeriamonocytogenes, роль, которых в патологии человека доказана, широко распространены в растениях (Гершун, 1979, 1980, 1988; Бакулов, 1991; Ганнушкин, 1971; Казаков, 1985). По данным В. И. Гершуна (1980а, 1988) листерии изолированы в 24% проб растений из береговых лесов Казахстана, в 9,5% - из пойменных лугов, в 8,6% - с пахотных земель, причем многие из этих изолятов были патогенными для мышей. При исследовании растительности с полей, лесов и лугов листерии обнаружены в 21 – 44% проб. Экспериментально установлен рост концентрации листерий в нестерильных растительных субстратах (наземные части, корни) и в силосе в течение 30 суток при низких температурах (Гершун, 1988). Благодаря активному размножению, листерии неопределённо долго (12 лет – срок наблюдений) существовали в растительных субстратах (Гершун, 1981).

Есть основания утверждать, что растения могут быть природным резервуаром патогенных листерий и источником заражения человека (теплокровных животных), подобно тому, как это признано в отношении животных при зоонозных инфекциях (Беляков, Литвин и другие, 1994).

Из литературы известно, что салат является идеальным фактором передачи инфекций, так как он не подвергается кулинарной обработке, а ополаскивание его даже мыльной водой или хлорсодержащими растворами не предотвращает инфицирования (Бакулов, 1991).

1. 6 Очаги овощных инфекций

Овощи поражается микроорганизмами еще прижизненно, а также в процессе транспортировки и хранения. Чаще всего плодоовощная продукция подвергается гниению, что обусловлено развитием бактерий (Беляков, 1964; Гаенко, 1971; Широков, 2008).

В городских очагах зараженные зверьки, выделяя возбудителя с мочой и калом, могут обсеменять предметы окружающей среды, в том числе и пищевые продукты.

Попадание возбудителя в пищевые продукты возможно в местах, доступных для грызунов, на складах, овощехранилищах. В этом случае инфицированы могут быть любые продукты — хлебобулочные и кондитерские изделия, фрукты, овощи и другие. Не исключена возможность загрязнения овощей на полях, где имеются природные очаги инфекции.

Роль разнообразных продуктов как факторов передачи инфекции различна. Наибольшее значение имеют овощи, которые длительно хранятся на складах, портятся, что благоприятно для размножения возбудителя (достаточный питательный субстрат, влажность, температура). Возбудители высеваются из смывов с инвентаря и тары, камер, где хранятся овощи, полов, полок. В связи с этим в овощехранилищах создаются условия для длительного существования возбудителя и заражения им вновь поступающих партий овощей через предметы окружающей среды, остатки овощей, иногда вне связи с грызунами. Обсеменение овощей и окружающей среды возможно не только на крупных базовых овощехранилищах, но и на небольших складах при пищеблоках (Гершун, 1971; Казаков, 1985; Сомов, 2004).

Ранние весенние овощи (зеленый лук, огурцы, зелень) могут обсеменяться при выращивании в теплицах и при их хранении. В овощехранилищах патогенные бактерии обнаруживаются всегда, но число положительных находок значительно увеличивается в зимне-весеннее время, чему способствуют условия хранения овощей. Именно такие овощи становятся фактором передачи инфекции.

Основная роль при заражении принадлежит овощам, которые употребляются в пищу без термической обработки в виде салатов.

Занос обсемененных овощей в пищеблоки создает опасность загрязнения помещений и инвентаря для их первичной обработки, что значительно увеличивает возможность попадания возбудителя инфекции в пищу. Существенное значение при этом имеет нарушение санитарных норм обработки овощей — их длительное содержание в грязной воде, отсутствие повторной промывки перед приготовлением салатов, длительное хранение готовых блюд, в том числе в холодильниках, где создаются условия не только для накопления возбудителей, но и продуктов их метаболизма, в частности токсичных. Овощные блюда — салаты из плохо промытых сырых овощей (моркови, капусты, лука, зелени) часто являются основной причиной заражения и заболевания человека.

1. 7 Листериоз. Общая характеристика возбудителя

Листериоз ещё пока мало известен в практическом здравоохранении, хотя история изучения возбудителя насчитывает более ста лет. Эта инфекция встречается на всех континентах, в странах с различными социально-экономическими и климатическими условиями.

До 80-х г.г. XX столетия листериоз не привлекал к себе большого внимания исследователей, поскольку заболеваемость им была не высокой, проявляющаяся в разных странах несколькими десятками случаев в год.

Положение с заболеваемостью листериозом коренным образом изменилось в 80-х г.г., когда в передовых зарубежных странах (США, Великобритания, Франция, Италия, Испания, Германия и др.) начали возникать эпидемические вспышки листериоза пищевого происхождения с тяжелым клиническим течением и летальностью до 24 – 40 %.

В Российской Федерации заболеваемость листериозом официально регистрируется с 1992 года и до настоящего времени продолжает оставаться на высоком уровне (40 – 100 случаями в год при отсутствии эпидимиологических вспышек). В связи с тем, что листериоз является в настоящее время всё ещё редко диагностируемым заболеванием и не всегда регистрируется, истинная распространённость этой инфекции среди людей неизвестна.

Редкая регистрация листериоза связана с недостаточным уровнем как клинической, так и лабораторной диагностики. Этим, в значительной мере, объясняется актуальность проблемы листериоза. Кроме того, актуальность листериоза связана с увеличением иммуносупрессивных больных, людей со сниженным Т – клеточным звеном иммунитета, которых наиболее часто поражает этот возбудитель.

Согласно определителю Берджи (9 – е издание) род Listeria относится к 19 - й группе микроорганизмов – грамположительные неспорообразующие палочки правильной формы.

Царство: Бактерии

Тип: Firmicutes

Класс: Bacilli

Порядок: Bacillales

Семейство: Listeriaceae

Вид: Listeria monocytogenes

В настоящее время из шести видов листерий только Listeriamonocytogenes патогенна для человека и животных.

Бактерии вида Listeriamonocytogenes представляют собой палочки (0,4 – 0,5 х 0,5 – 2 мкм) с закруглёнными концами (рисунок 15), иногда почти кокки, факультативные анаэробы, рост которых усиливается при повышенном содержании углекислого газа в атмосфере инкубации 5 – 7 %. Оптимальная температура роста 30 – 37^о С, хотя листерии, как факультативные психрофилы, хорошо размножаются при низких температурах 4 – 6^о С («микроб холодильников»).

Р и с у н о к 15 - Внешний вид Listeriamonocytogenes

При 20 – 25^оС листерии подвижны за счёт образования немногочисленных перитрихиальных жгутиков, при 37^оС жгутики, как правило, не образуется, и листерии не подвижны.

Строение клеточной стенки Listeriamonocytogenes типично для грамположительных бактерий. Её основой является пептидогликан, в состав которого входят углеводы, тейхоевые кислоты, липопротеины и поверхностные белки.

Известно 16 серовариантов Listeriamonocytogenes. В отечественной серологии серовары 1/2а, 1/2b, 1/2c, 3а, 3b, 3с объединены в серогруппу I, остальные серовары – 4а, 4аb, 4b, 4с, 4d, 4е, 7 – в серогруппу II. Наиболее часто у людей вызывают заболевания сероварианты – 1/2а, 1/2b и 4b. Штаммы сероварианта 4b вызывают около 50% случаев листериоза в мире.

Листерии инактивируются под воздействием солнечных лучей. Гибель микроорганизмов наблюдается при 70^оС через 20 – 30 минут, при 100^оС – 3-5 минут; они инактивируются раствором формалина (0,5 – 1%), фенола (5%), хлорной извести (100 мл активного хлора на 1 л).

Листерии ферментируют глюкозу, каталазоположительны, оксидазоотрицательны, образуют цитохромы, некислотоустойчивы, не образуют споры и капсулы, хемоорганогетеротрофы. Патогенные виды вызывают листериоз.

Глава 2 Объекты и методы

2.1 Объекты исследований

В качестве объектов исследования было использовано несколько сортов салата (Lactucasativa) таких как: Эндивий Нежный, Лоло – росса, Кучерявец Одесский из семейства Сложноцветных; Рукола из семейства Валериановых и Корн из семейства Крестоцветных. В работе использовали 11 штаммов Listeriamonocytogenes: 37206/4, 8708, 9148/1, 6144, 4835/6, 15861, 2780, 564216, 12731188077, 9156/2, 12734/38097 (Таблица А. 1).

В экспериментальных исследованиях были использованы также штаммы сапротрофных бактерий, выделенные нами из листьев различных сортов салата.

1.  

   1. Методы идентификации

2.2.1Окраска по методу Грама

В основе метода лежит способность клеток воспринимать и удерживать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового и йода, либо терять его после обработки спиртом.

В мазках листерии окрашиваются в фиолетовый цвет, располагаются одиночно, парами или в коротких цепочках, в виде цифр V, реже образуют длинные нити.

1.  
   1.  

      1. Определение каталазы

Фермент каталаза способствует разложению перекиси водорода, образующейся во время окислительно – восстановительной реакции:

2Н₂О₂ + каталаза = 2Н₂О + О₂.

При наличии каталазы происходит разложение перекиси водорода с выделением пузырьков кислорода. Все листерии каталазоположительные.

1.  
   1.  

      1. Определение гемолитической активности бактерий

Образование зон просветления при посеве исследуемых культур на поверхности кровяного агара происходит за счёт растворения эритроцитов вокруг колоний.

Исследуемую суточную культуру засевают штрихом на кровяной агар вместе с контрольными штаммами. Посевы на кровяном агаре инкубируют при 37^оС в течении 24 – 48 часов.

Listeriamonocytogenes обладают β–гемолитической активностью, образуя узкую зону просветления среды вокруг выросшей культуры.

1.  
   1.  

      1. Определение ферментативных свойств

При интерпретации результатов биохимической идентификации листерий важно понимание относительного значения каждого взятого в отдельности теста. Только совокупность нескольких родоспецифических и видоспецифических тестов позволяет достоверно идентифицировать вид листерий.

В качестве материала использовали: среды Гисса, содержащие рамнозу, ксилозу, маннозу, маннит.

Рост микроорганизмов на средах с углеводами может приводить к накоплению органических кислот, нейтральных продуктов и газов. Образование кислот регистрируется по изменению рН среды, о чём свидетельствует изменение окраски индикатора (бромтимоловый синий, бромкрезоловый пурпурный и другие). Образование газа определяют по появлению на поверхности среды пены или разрывов и пузырьков в толще среды (Таблица 1).

С помощью бактериологической петли уколом испытуемый микроорганизм засевали в среду КД на чашки Петри. Инкубируют в течение 4 – х суток при температуре 35 – 37^оС (Рисунок 16).

Р и с у н о к 16 - Тест на определение ферментативных свойств

Т а б л и ц а 1- Биохимические свойства бактерии Listeria monocytogenes

Вид	Ферментация сахаров
	Рамноза	Ксилоза	Манноза	Маннит
Listeria monocytogenes	+	-	+	-

1.  
   1.  

      1. Тест на лицетиназу

Лецетиназа (фосфатидилхолинспецифичная фосфолипаза) – необходима для выживания и размножения листерий в процессе внутриклеточной инфекции. При культивировании на питательных средах с лицетином, лицетиназная активность у Listeriamonocytogenes не выявляется или не определяется очень слабо за счёт секреции продукта с функцией ауторепрессора. Он устраняется из среды с помощью активированного угля, в результате чего происходит активация генов патогенности и увеличение в среде уровня лицетиназы.

Разделили на несколько квадратиков или секторов дно двух чашек Петри со средой ГРМ, содержащих: первая чашка – желток куринного яйца и активированный уголь, а вторая чашка – желток куриного яйца. Исследуемые культуры и контрольные штаммы листерий пересеяли параллельно короткими штрихами на соответствующие сектора чашек содержащих и не содержащих активированный уголь. Инкубировали при 37^оС в течении 48 часов. Чашки просматривали в проходящем свете.

Listeriamonocytogenes даёт плотную зону помутнения в присутствии активированного угля вокруг колонии на среде ГРМ (Рисунок 17) и не дает при отсутствии угля.

Р и с у н о к 17 - Тест на лицетиназу

1.  

   1. Микроорганизмы и среды

При проведении экспериментальных исследований были использованы штаммы Listeriamonocytogenes (37206/4, 8708, 9148/1, 6144, 4835/6, 15861, 2780, 564216, 12731188077, 9156/2, 12734/38097), которые были типичны по своим культуральным, серологическим и биохимическим свойствам.

В исследованиях использовали также штаммы сапротрофных бактерий, выделенных из салатов разных сортов.

В экспериментах использовали следующие среды:

1) Для наращивания биомассы исследуемых бактерий использовали казеиново – дрожжевой агар (КД) с 0,2 % раствором глюкозы;

2) Для наращивания сапротрофной биомассы использовали среду Ишемицу – Кимура (ИК);

3) Для изучения динамики роста и размножения исследуемых бактерий использовали суспензии салатов: Эндивий Нежный, Лоло – росса, Кучерявец Одесский, Рукола, Корн;

4) Для изучения биологических свойств исследуемых бактерий использовали: КД + крахмал, КД + молоко, КД + твин 20, КД + твин 60, КД + твин 80, ГРМ + Ж + уголь, ГРМ + Ж, КД + кровь;

5) Раствор Патерсона – Кука – контрольная среда для сравнительных исследований размножения листерий при периодическом культивировании.

1. Результаты и обсуждения

3.1 Влияние различных концентраций листового салата на рост и размножение Listeriamonocytogenes

В эксперименте был использован один сорт салата - Эндивий Нежный, наиболее распространенный продукт на рынке г.Владивостока. Поверхность растения, и главным образом поверхность листьев (филлосферы), является местом обитания разнообразных микроорганизмов. Бактерии не только находятся на поверхности листьев, но и активно там развиваются (Ларионов, 1988). Предпосылкой данного выбора является то, что на салате поселяется большое количество бактерий, которые способны использовать растение как питательную среду для своего роста и размножения (Сидоренко, 2003).

По данным литературы, листерии довольно часто контаминируют салаты (Бакулов, 1991), в связи с этим являются опасными для здоровья человека, т.к. салат не подвергается кулинарной обработке, а ополаскивание его мыльной водой или хлорсодержащими растворами для обеззараживания - недопустимо.

При проведении экспериментальных исследований был использован один из сортов салата - Эндивий Нежный. Его использовали в качестве среды для Listeria monocytogenes.

На первом этапе работы растение промывали, высушивали при комнатной температуре, затем его растирали в ступке до образования кашицы. В образовавшуюся массу мерно добавляли с помощью стерильной пипетки 50 мл раствора Патерсона – Кука, (1г – 50 мл; 2г – 100 (2%-й раствор) мл). В полученную суспензию вводили взвеси исследуемых микроорганизмов. Второй вариант среды готовили также, но с добавлением концентрированного 0,1% раствора глюкозы. В течение 7 – 12 дней следили за ростом бактерий с помощью прибора – спектрофотометра, измеряющего спектр мутности раствора. Замер каждой пробы, производили трижды. Полученные результаты заносили в таблицу (Таблица А. 2) и строили график (Рисунок 18). Все цифровые данные, полученные в результате исследований, подвергали статистической обработке с использованием компьютерной программы Excel.

Среда: раствор Патерсона – Кука + 1мл - (0,2 %); 5 мл - (1%); 10 мл - (2 %) листьев салата.

Оптимальной концентрацией суспензии салата, при которой наблюдали наибольший рост и размножение бактерий – 2 % - й раствор (Рисунок 18).

Результаты опыта, представленные на рисунке 18, свидетельствуют о том, что листья салата оказывают стимулирующее действие на рост и размножение Listeriamonocytogenes. Как показано на рисунке, активный рост исследуемых бактерий, относительно контроля, наблюдается уже на вторые сутки эксперимента.

Если брали большие концентрации салата – 5% (1г), 10% (5г), то активного роста исследуемых культур не наблюдали, т.е. высокие концентрации субстрата подавляли размножение бактерий, что согласуется с данными литературы (Позмогова, Работнова, 1988).

Р и с у н о к 18 - Кривая роста Listeria monocytogenes в среде: раствор Патерсона – Кука + 0,2%; 1%; 2% раствор листьев салата.

Очевидно, что активному размножению листерий в растительном субстрате способствуют такие факторы как: оптимальный рН среды (7,2 – 7,4), влажность и доступность питательных веществ. Так по данным М.Л. Сидоренко (2004) растительные субстраты содержат в основном моносахара ( глюкоза, галактоза) и дисахара ( лактоза), которые являются доступными для микроорганизмов и легко проникают в микробную клетку.

Таким образом, результаты эксперимента показали, что салат, как культура, является благоприятной средой для роста и размножения Listeriamonocytogenes.

3.2 Влияние различных сортов и частей листового салата на рост и размножение Listeriamonocytogenes

На следующем этапе работы необходимо было исследовать, какие части салата являются наиболее оптимальными для размножения листерий, использующих их как среду обитания. Данных в литературе по этому вопросу нами не было обнаружено.

При проведении опыта было использовано 5 сортов салата: Лоло – росса, Кучерявец Одесский, Горчичный, Эндивий Нежный, Рукола.

На первом этапе работы производилась подготовка посуды для проведения опыта и её стерилизация. Листья салата промывали водопроводной водой и высушивали при комнатной температуре. Затем взвешивали его отдельные части (лист, стебель и корень) в пределах 1 грамма и растирали в ступке до образования кашицы или однородной массы. После чего полученные массы профильтровали. В результате было получено 9 сред:

1. Лолла – росса (лист);

2. Кучерявец Одесский (лист);

3. Горчичный салат (лист);

4. Горчичный салат (стебель);

5. Рукола (Лист);

6. Рукола (стебель);

7. Эндивий Нежный (лист);

8. Эндивий Нежный (стебель);

9. Эдивий Нежный (корень).

С помощью стерильной пипетки в каждую из сред мерно добавляли по 50 мл раствора Патерсона - Кука. Полученные среды подвергались стерилизации.

Listeriamonocytogenes высевали на косой питательный агар. Выросшую культуру смывали раствором Патерсона – Кука и добавляли 2 мл в приготовленные питательные растительные среды. В течение двух недель следили за ростом Listeria monocytogenes с помощью спектрофотометра, прибора измеряющего оптическую плотность раствора. Замер каждой пробы, производился трижды. Полученные результаты заносили в таблицу (Таблица 2) и строили график – кривую роста (Рисунок 19).

Все цифровые данные, полученные в результате исследований, подвергались статистической обработке с использованием компьютерной программы Exel.

Т а б л и ц а 2 - Рост и размножение Listeriamonocytogenes на растительном субстрате

№ среды	Сутки
	1	2	3	4	7	8	9	10
Контроль	0,088	0,077	0,070	0,065	0,095	0,131	0,173	0,187
1	0,167	0,273	0,277	0,261	0,252	0,240	0,259	0,250
2	0,165	0,259	0,288	0,225	0,128	0,153	0,164	0,165
3	0,183	0,317	0,298	0,292	0,171	0,288	0,263	0,292
4	0,146	0,253	0,216	0,197	0,116	0,098	0,071	0,123
5	0,135	0,273	0,221	0,2	0,256	0,485	0,440	0,384
6	0,24	0,28	0,29	0,25	0,21	0,21	0,35	0,36
7	0,251	0,236	0,215	0,294	0,156	0,346	0,365	0,340
8	0,10	0,186	0,138	0,134	0,061	0,061	0,078	0,126
9	0,125	0,150	0,135	0,221	0,274	0,215	0,244	0,233

Р и с у н о к 19 - Динамика роста и размножения Listeriamonocytogenes в средах, приготовленных из различных сортов и частей листового салата

Р и с у н о к 20 - Сравнительная характеристика М-концентраций листерий, выросших на субстратах, приготовленных из различных частей разныз сортов салатов.

Исходя из данных, представленных на рисунке 19, можно отметить, что максимальная М – концентрация зарегистрирована на 2 – е сутки у таких сортов салата как: Горчичный салат (лист), Эндивий Нежный (лист), Рукола (лист, стебель). Наиболее интесивный рост исследуемых бактерий наблюдался в среде, приготовленной из листовой части Эндивия Нежного и Руколы (Рисунок 20). Максимальные показатели роста бактерий в данной среде были зарегистрированы на восьмые сутки эксперимента, и являются лучшими показателями роста из всех представленных сред, приготовленных из различных частей разных сортов листового салата.

3.3 Выделение в культуру штаммов сапротрофных бактерий, населяющих поверхность листа разных сортов салата

Известно, что микроорганизмы, обитающие на растениях (филосфера) в сообществах, способны как угнетать, так и стимулировать процессы размножения друг друга, в частности через воздействие выделяемых ими метаболитов (Тиранен, 1980, 1989). Поскольку листерии способны жить и размножаться на салате, представляло интерес изучить их взаимодействие с другими членами сообщества микроорганизмов, населяющих листовую пластину салата.

Каждый из сортов салата, используемых в работе: Эндивий Нежный (1), Кучерявец Одесский (2), Лоло - росса (3), Рукола (4), Корн (5), помещали в отдельные чашки Петри с агаризированной средой, засевая микрофлору, находящуюся на поверхности листа, методом отпечатка. Чашки оставляли при комнатной температуре на сутки. При этом наблюдали рост разных видов колоний микроорганизмов во всех чашках с посевами (Рисунок 21).

После чего отмечали разные виды колоний, выросших в каждой из чашек (Таблица Б. 1).

Всего был отмечен 21вид колоний на всех исследуемых салатах:

- Эндивий Нежный – 2 колонии;

- Кучерявец Одесский – 3 колонии;

- Лоло – росса – 6 колоний;

- Рукола – 6 колоний;

- Корн – 4 колонии.

1 2 3

4 5

1 - Эндивий Нежный , 2 - Кучерявец Одесский, 3 - Лоло – роса, 4 – Рукола, 5 – Корн

Р и с у н о к 21 - Колонии бактерий с поверхности салатов на твёрдой агаризованной среде

Каждую колонию откалывали бактериологической петлей и высевали на косой питательный агар (Рисунок 22). Полученные посевы оставляли при комнатной температуре на сутки, используя подросшие культуры для дальнейших экспериментов.

Р и с у н о к 22 - Рост микроорганизмов на косых питательных средах

Описание морфологии колоний сапротрофов , выделенных с поверхности разных сортов салатов показаны в таблице Б. 1.

1.  

   1. Влияние летучих метаболитов сапротрофных бактерий на рост Listeriamonocytogenes

Для оценки действия летучих биологически активных веществ, продуцируемых эпифитной микрофлорой растений (салатов) на рост патогенных бактерий использовали метод, предложенный Л. С. Тирранен (1989) в нашей модификации. Для этого 3мл физиологического раствора смывали выросшую культуру сапротрофных бактерий на косом питательном агаре, и производили посев сплошным «ковром» или «газоном» на ИК среду на одну половину чашки Петри, а на вторую половину засевали 11 штаммов Listeria (Таблица А. 1) на КД среду, методом укола. В эксперименте использовали две среды: КД - питательный агар на кормовых дрожжах – для листерий и среда Ишемицу – Кимура – для сапротрофов.

Склеивали обе половинки чашки Петри с посевами между собой (КД – ИК) и оставляли при комнатной температуре на несколько дней (Рисунок 23).

Р Р и с у н о к 23 - Влияние летучих метаболитов на рост листерий

Затем производили замер выросших колоний Listeria. Данные заносили в таблицу (Таблица 3).

По данным таблицы 3 стимулирующей активностью в отношении листерий обладали сапротрофные штаммы №: 2.3 (Кучерявец Одесский + Listeria 9148/1); 3.3 (Лоло – росса + Listeria 9148/1) и 5.3(Корн + Listeria 9148/1), которые и были использованы для дальнейших экспериментов.

Т а б л и ц а 3 – Активность летучих метаболитов эпифитных бактерий разных сортов салатов, в отношение размножения штаммов листерий (мм)

№ культуры сапрофитных бактерий	№ штамма Listeria monocytogenes
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
1. 3	4	5	3	5	6	5	4	6	6x3	4	4
1. 4	4	3	5	5	5	6	5	5	4	3	4
2. 1	5	4	5	6	6	8x5	5	4	6	4	5
2. 2	-	6	4	4	6	6	7	4	5	4	5
2. 3	7	6	7	7	7	5	7	6	6	6	7
3. 1	5	7	5	4	6	4	4	4	7	10x4	5
3. 2	10x5	4	5	6	4	6	5	4	7	3	6
3. 3	5	5	6	3	11x5	6	6	6	6	5	5
3. 4	4	3	3	4	4	5	6	5	8	4	7
3. 5	6	5	6	4	6	5	6	4	10x6	5	9
3. 6	8	6	6	5	-	6	5	5	6	5	5
4. 1	5	6	7x4	4	6	6	-	6	6	5	5
4. 2	6	5	5	5	4	4	3	4	5	4	5
4. 3	5	5	4	6	4	5	5	3	5	3	5
4. 4	5	6	6	6	6	7	3	4	5	5	5
4. 5	6	5	4	4	6	4	6	5	5	5	6
4. 6	6	6	5	5	6	6	4	5	5	6	5
5. 1	6	5	5	6	6	4	6	6	6	5	6
5. 2	6	4	5	5	6	5	4	4	5	3	5
5. 3	5	4	5	5	7	7	7	5	9	8	10
5. 4	7	4	5	5	6	8	5	7	5	4	6

Примечание: порядковые номера культур сапротрофных бактерий даны в соответствии с данными, представленными в таблице 1 приложения Б.

1.  

   1. Влияние экзометаболитов эпифитных бактерий листьев салата на рост разных штаммов Listeriamonocytogenes

Для того чтобы получить экзометаболиты выделенных сапрофитов, необходимо было вырастить культуру на скошенном агаре. Смыв каждой культуры производили раствором Патерсона – Кука (минеральная среда) с последующим центрифугированием при скорости 5000 об / мин в течение 15 минут. Полученный центрифугат пропускали через бактериальный фильтр (0,22 ммк) (Рисунок 24). После чего, полученные экзометаболиты сапрофитов добавляли по 2 мл в опытные флаконы с раствором Патерсона – Кука объемом 50 мл. Полученные растворы заражали культурой листерий штамма 9148/1 в количестве 10⁹ КОЕ/ мл (по стандарту мутности). Доводили концентрацию листерий в растворе до оптической плотности 0,1 при длине волны на спектрофотометре 590. Наблюдали рост листерий под влиянием экзометаболитов в течение девяти суток.

Р и с у н о к 24 – Внешний вид бактериального фильтра

Данные заносили в таблицу (Таблица 4) и строили графики.

Т а б л и ц а 4 –Влияние экзометаболитов сапротрофных штаммов, выделенных с поверхности листового салата, на размножение разных штаммов листерий

№ листерии	№ пробы	Сутки
		1	2	3	4	7	8	9	10
Листерия 37206/4 (№1)	Контроль	0,054	0,116	0,121	0,15	0,157	0,151	0,157	0,094
	2. 3 + листерия №1	0,069	0,197	0,224	0,236	0,254	0,255	0,228	0,212
	3. 3 + листерия №1	0,058	0,162	0,156	0,144	0,173	0,191	0,206	0,207
	5. 3 + листерия №1	0,061	0,176	0,255	0,32	0,348	0,385	0,346	0,306
Листерия 8708 (№2)	Контроль	0,076	0,259	0,266	0,256	0,22	0,199	0,189	0,142
	2. 3 + листерия №2	0,074	0,352	0,424	0,376	0,329	0,322	0,377	0,444
	3. 3 + листерия №2	0,076	0,316	0,386	0,359	0,296	0,306	0,277	0,293
	5. 3 + листерия №2	0,09	0,321	0,401	0,416	0,329	0,326	0,43	0,442
Листерия 9148/1 (№3)	Контроль	0,075	0,211	0,205	0,203	0,196	0,175	0,168	0,132
	2. 3 + листерия №3	0,075	0,211	0,205	0,203	0,196	0,175	0,168	0,223
	3. 3 + листерия №3	0,086	0,333	0,379	0,339	0,289	0,281	0,26	0,215
	5. 3 + листерия №3	0,078	0,343	0,414	0,421	0,467	0,447	0,455	0,423
Листерия 6144 (№4)	Контроль	0,091	0,223	0,258	0,249	0,24	0,228	0,219	0,185
	2. 3 + листерия №4	0,091	0,225	0,258	0,249	0,24	0,228	0,219	0,589
	3. 3 + листерия №4	0,094	0,288	0,352	0,383	0,369	0,379	0,379	0,334
	5. 3 + листерия №4	0,125	0,417	0,478	0,509	0,669	0,747	0,806	0,841

Как видно из данных, представленных на рисунке 25, наиболее активное размножение Listeriamonocytogenes штамма 37206/4, наблюдали на экзометаболитах сапротрофного штамма – 5. 3, выделенного с поверхности листового салата сорта Корн. В остальных случаях интенсивность размножения листерий была менее выражена.

Р и с у н о к 25 – Динамика размножения Listeriamonocytogenes шт. 37206/4 на экзометаболитах сапротрофных штаммов

Результаты опыта, представленные на рисунке 26, свидетельствуют о том, что Listeriamonocytogenesштамма 8708 практически одинаково размножались во всех вариантах опыта. При этом культура листерий достигала своего максимального роста уже на третьи сутки эксперимента.

Р и с у н о к 26 – Динамика размножения Listeriamonocytogenes штамма 8708 на экзометаболитах сапротрофных штаммов

Исходя из данных, представленных на рисунке 27, можно отметить, что во всех вариантах опыта наблюдалось активное размножение Listeriamonocytogenes штамма 9148/1, также на третьи сутки эксперимента. Но наибольший рост листерий наблюдали на экзометаболитах сапротрофного штамма – 5. 3 выделенного с поверхности листового салата сорта Корн.

Р и с у н о к 27 – Динамика размножения Listeria monocytogenes штамма 9148/1 на экзометаболитах сапротрофных штаммов

Как видно из данных, представленных на рисунке 28, наиболее активное размножение Listeriamonocytogenes штамма 6144, наблюдали в присутствии метаболитов сапротрофного штамма – 5. 3. В остальных случаях активного размножения исследуемых штаммов бактерий, относительно контроля не наблюдали.

Р и с у н о к 28 – Динамика размножения Listeriamonocytogenes штамма 6144 на экзометаболитах сапротрофных штаммов

В результате проведённых исследований установлено, что наиболее активное размножение всех исследуемых штаммовListeriamonocytogenes происходит под влиянием экзометаболитов сапротрофа шт. 5. 3, выделенного с поверхности листового салата сорта Корн. При этом наибольшие значения М –концентрации Listeriamonocytogenesбыли зарегистрированы дляштамма 6144.

Таким образом, исходя из данных, полученных в результате эксперимента, было установлено, что салат, как культура является благоприятной питательной средой для роста и размножения Listeriamonocytogenes, а сапротрофная микрофлора, находящаяся на поверхности листьев салата, оказывает стимулирующее действие на размножение листерий.

1. Выводы

1. Установлено, что листья салата являются благоприятной средой обитания Listeriamonocytogenes, чему способствует наличие оптимального рН , влаги и доступных питательных веществ;

2. В модельных экспериментах при периодическом культивировании было установлено, что оптимальной средой для роста и размножения Listeriamonocytogenes является 2% концентрация листового салата;

3. Интенсивность роста и размножения листерий зависит от сорта растения, которое они контаминируют. Исследуемые сорта листового салата, по степени их стимуляции роста и размножения Listeriamonocytogenes, можно расположить в следующий ряд: Корн > Рукола > Эндивий Нежный > Горчичный > Кучерявец Одесский > Лоло – росса;

4. Наиболее благоприятной для размножения Listeriamonocytogenes является листовая часть листового салата по сравнению со стеблем;

5. Экзометаболиты сапротрофных микроорганизмов, оказывают стимулирующее действие на размножение Listeriamonocytogenes, находящейся с ними в ассоциации;

6. В результате проведённых исследований установлено, что наиболее активное размножение Listeriamonocytogenes происходило под влиянием экзометаболитов сапротрофов, выделенных с поверхности листового салата – Корн. Наиболее стимулируемым, из всех исследуемых листерий, в отношении роста и размножения является штамм Listeriamonocytogenes - 6144.

Список литературы

1. Айзенман Б. Е. Антибиотические свойства бактерий. – Киев: Наукова Думка, 1973. – 182 с.

2. Алборишвили Ч. А. Изменчивоть хозяйственно-биологических особенностей сортов салата и кориандра в зависимости от сроков посева. Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. 1971, т.45, вып.1, с.216-227.

3. Алиев З. А., Дюкарев Ю. А., Латенко Б. В. Выращивание овощей в теплицах без почвы. Киев, 1971, 231 с.

4. Анасимова Н. А. Калькуляция себестоимости овощей в теплицах. – Картофель и овощи, 1968. № I, с. 28-29.

5. Андреев Ю. М., Лёбл Д. О., Москвичева В. Г. Рассада овощных культур для зимних теплиц. Картофель и овощи, 1978, № I, с.33.

6. Андреюк Е. И., Валагурова Е. В. Основы экологии почвенных микроорганизмов. – Киев, Наукова Думка, 1992. – 224 с.

7. Бакулов И. А., Котляров В. М., Шестиперова Т. И. Листериоз – пищевая инфекция (масштабы опастности и меры борьбы) // Ветеринария. – 1991. - № 4. – с. 32 – 36

8. Бакулов И. А., Котляров В. М., Шестиперова Т. И. Эпидемиологические и эпизоотологические аспекты листериоза. // Журн. Микробиол., эпидимиол. И иммунобиол. – 1994. - №5. – с. 100 – 105.

9. Беляков В. Д. Эпидемиологический процесс. Теория и методы изучения. – Л.: Медицина, 1964. – 244 с.

10. Беляков В. Д., Литвин В. Ю. Патогенные бактерии, общее для человека и растений // Патогенные бактерии в сообществах. – М., 1994. – с. 13 – 14.

11. Берестецкий О. А., Кравченко Л. В., Азарова Т. С. Использование почвенными микроорганизмами летучих выделений прорастающих семян как источника углерода и энергии. // Журн. Микробиол. – 1981. – т. 50, вып. 5. – с. 898 – 902

12. Бексеев Ш. Г. Овощеводство Финляндии. Научные труды Северо – Западного НИИСХ. Выпуск XXX. Овощеводство. Ленинград, 1974, с.121-161. Бентли М. Промышленная гидропоника. Пер. с англ. М.: Колос, 1965, 375 с.

13. Богоев В. М., Гильманов Т. Г. Численность и биомасса микроорганизмов в почвах некоторых зональных экосистем. // Биологические науки. - № 7. – 1982. – с. 12 – 24.

14. Большунов В. Л. Агротехника кочанного салата, цветной капусты, томата и кабачка в нестационарных пленочных теплицах. – Автореф. Канд. Дис ., Ленинград – Пушкин, 1971, с. 18.

15. Большунов В. Л., Койвунен Т. М. Высокие урожаи овощей. – Л.: Колос, Ленинградское отд., ЮТ, 1971, 192 с.

16. Брежнев Д. М. Томаты. – Л.: Колос, 1994, 320 с.

17. Брызгалов В. А., Советкина В. К., Савинова Н. И. Овощеводство защищенного грунта./Под. Ред. В. А. Брызгалова. – Л.: Колос, Ленинград, отд., 1983, 352 с.

18. Брызгалов В. А., Вересов К. Н. Овощеводство. – Л – М.: Сельхозиздат, 1972, с. 270.

19. Брызгалов В. А., Каратаев Е. С., Болыпунов В. А. Культура кочанного салата и томата в нестационарных теплицах. Записи Ленинградского СХИ, т.159, 1971, с. 83-88.

20. Брызгалов В. А., Котов В. П., Халмирзаев Б. Х. Осенняя культура кочанного салата в зимних теплицах. Расширение ассортимента и круглогодовое производство овощей, т.211. Ленинград – Пушкин, 1972, с.83-88.

21. Бурова В. В. Перспективы сорта кочанного салата для весеннего выращивания в передвижных пленочных теплицах. Труды Северо – Западного НИИСХ. Овощеводство. 1974, вып. 30, с. 397.

22. Бурова В. В. Сорта кочанного салата для осеннего выращивания в передвижных пленочных теплицах Северо – Западной зоны. Труды Северо – Западный НИИСХ. Овощеводство. 1974, вып.30, с. 101.

23. Василенко Н. Г. Малораспространенные овощи и пряные растения М.: Сельхозиздат, 1962, 213 с.

24. Ващенко С. Ф. Основные направления развития овощеводства защищенного грунта и итоги исследований. Тезисы выступлений на научной конференции посвященной 50-летиго Великой Октябрьской Социалистической революции. НИИОХ. МСХ РСФСР. М., 1967, с. 376.

25. Ващенко С.Ф. Рекомендации по выращиванию овощей в теплицах без почвы. – М.: Сельхозиздат, 1963, 40 с.

26. Ващенко С. Ф. О развитии овощеводства защищенного грунта. Передовой опыт и достижения науки и специализации и концентрации овощных культур и картофеля в Нечерноземной зоне (Тезисы докладов). М., 1975, с. 28-33.

27. Власюк П. А. Методы и задачи гидропоники. В Н.: Гидропоника в сельском хозяйстве. – М.: Колос, 1965, с. 5-9.

28. Временные методические указания по постановке опытов в сооружениях защищенного грунта. – М., 1970, с. 74.

29. Гаенко Н. П., Лёбл Д. О. Тепличное овощеводство Голландии, - М.: Колос, 1971, 184 с.25

30. Ганнушкин М. С. Курс эпизоотологии. – М.: Сельхозгиз, 1952. – 432 с.

31. Гершун В. И. Влияние различных почв на выживаемость возбудителя листериоза // Ветеринария. – 1971. - № 1. – с. 32 – 33.

32. Гершун В. И. Способность листерий размножаться в растительных субстратах // Вестник с – х. науки Казахстана. – 1979. - № 4. – с. 91 – 92.

33. Гершун В. И. Распространение листерий в объектах внешней среды. // Изв. АН Казвхской ССР. Серия биологическая. – Алма – Ата, 1980. - № 6. – с. 42 – 44.

34. Гершун В. И. Влияние абиотических факторов на жизнеспособность листерий в почве. // Сиб. Вестник с – х. науки. – Новосибирск, 1980. - № 3. – с. 78 – 81.

35. Гершун В. И. Экология листерий и пути их циркуляции в природном очаге. // Экология возбудителей сапронозов. – М. – 1988. – с. 80 – 85.

36. Громов Б. В., Павленко Г. В. Экология бактерий. – Л.: Издательство Ленинградского университета, 1989. – 248 с.

37. Дадыкин В. П., Степанов Л. Н., Рыжова В. Е. О значении летучих выделений растений при разработке закрытых систем // Физиолого – биохимические основы взаимодействия растений в фитоценозах. Киев: Наукова Думка, 1970. – 118 с.

38. Елкин И. И. Очерки теории эпидемиологии. – М.: Медгиз, 1960. – 215 с.

39. Зайцева Е. А., Терехова В. Е. Эколого – эпидемические особенности Listeria monocytogenes в Приморском крае // Тихоокеанский Мед. журн. – 2001. - № 2. – с. 29 – 31.

40. Звягинцев Д. Г. Взаимодействие микроорганизмов с твёрдыми поверхностями. – М.: Издательство МГУ, 1973. – 176 с.

41. Звягинцев Д. Г. Почва и микроорганизмы. – М.: Издательство МГУ, 1987. – 256 с.

42. Зенова Г. М. Роль метаболитов во взаимодействиях микроорганизмов в ассоциациях природных экосистем // Экологическая роль микробных метаболитов. – М.: Издательство МГУ, 1986. – с. 166 – 177

43. Казаков А. В. К вопросу об экологии возбудителя листериоза. // Журн. микробиол., эпидимиол. и иммунобиол. – 1985. - № 5. – с. 91 – 98.

44. Казаков А. В. К вопросу об экологии возбудителя листериоза. // Журн. микробиол., эпидимиол. и иммунобиол. – 1993. - № 5. – с. 113 – 114.

45. Клюйвер А., Ван Ниль К. Вклад микробов в биологию. – М., 1959.

46. Кожевин П. А. Микробные популяции в природе . – М.: Издательство МГУ, 1989. – 170 с.

47. Кравченко Л. В., Фомичева А. П. Содержание летучих органических соединений у проростков семян злаковых и бобовых культур // Микробиологические процессы в почвах и урожайность сельскохозяйственных культур. Вильнюс: Издательство АН Лит. ССР, 1978. – 171 с.

48. Красильников Н. А. Антагонизмы микробов и высших растений. – М.: Советская наука, 1958. – 340 с.

49. Лабинская А. С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М., Медицина, 1978. – 394 с.

50. Ларионов Г. М. К эколого – биологическому содержание сапронозов. // Журн. микробиол., эпидимиол. и иммунобиол. – 1988. - № 3. – с. 36 – 39.

51. Сомов ,Литвин,

52. Пересыпкин В. Ф. Сельскохозяйственная фитопатология / В. Ф. Пересыпкин – М.: Наука, 1974. – 17 – 25 с.

53. Cидоренко М. Л., Влияние абиотических и биотических факторов почвенных экосистем на рост и размножение патогенной микрофлоры / М. Л. Cидоренко – Владивосток, 2003. – 35 – 39 с.

54. Сомов Г. П., Бузолёва Л. С. Адаптация патогенных бактерий к абиотическим факторам окружающей среды / Г. П. Сомов, Л. С. Бузолёва – Владивосток: ОАО «Примполиграфкомбинат», 2004. – 27 – 32 с.

55. Тарр С. А. Основы патологии растений : пер. с англ., под ред. М. С. Лунина – М.: Наука, 1975. – 12 – 21 с.

56. Тиранен, Л.С. Роль летучих метаболитов в межмикробном взаимодействии. Новосибирск /Л.С. Тирранен – Наука: Сиб. отд-ние, 1989. – 104с.

57.Тиранен, Л.С. Характер взаимодействия микроорганизмов через их газообразные метаболиты /Л.С. Тирранен., Б.Г. Ковров, О.А. Черепанов // Журн. микробиол. – 1980. – Т. 49, вып. 5. – С. 788 – 793.

58. Широков Е.П. Технология хранения и переработки овощей с основами стандартизации / Е.П. Широков – М.: Агропромиздат, 2008. – 42 -47 с.

 

Код для цитирования: Скопировать