VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014

Введение

Экологические и энергетические кризисы требуют самого широкого вовлечения нетрадиционных, экологически чистых источников энергии в народное хозяйство, путем переработки органических отходов животноводства.

Одним из таких источников является переработка органических отходовс помощью селекционированных анаэробных микроорганизмов - метаногенов.

Целью данной работы является разработка высокоэффективной закваски анаэробных микробов для получения органических удобрений и биогаза метана-альтернативного источника энергии экологически безопасных технологии переработки животноводческих отходов с получением органических удобрений.

Объекты исследования.

Отобраны образцы свежего навоза из КРС. Точки пробоотбора выбраны на месте в соответствии с требованиями, предъявляемыми к образцам: влажность, температура, значение рН 6,8-8,0. Отбор пробных образцов навоза проводили в соответствии с общепринятыми и разработанными в лаборатории методами [1].

Характеристика образцов. Метанообразующие бактерии предъявляют к условиям своего существования значительно более высокие требования, чем кислотообразующие – они нуждаются в абсолютно анаэробной среде и требуют более длительного времени для воспроизводства [2].

Таким образом отбор образцов свежего навоза КРС, осуществляли в строго герметичных сосудах. Необходимые условия для активного метанообразования приведены в таблице - 1.

Таблица 1 – Характеристика образцов проб свежего навоза из КРС.

Вид пробы	Наименование проб	Кол-во проб	рН	Температура, 0С	Влажность
навоз	проба №1 проба №2 проба №3 проба №4 проба №5 проба №6 проба №7 проба №8 проба №9 10) проба №10	2 2 2 2 2 2 2 2 2 2	6,8 6,9 6,9 7,2 7,5 6,8 6,9 6,9 7,2 7,5	25,0 - - - - - - - - -	50% воды - - - - - - - - -

Методика исследования.

Накопительные культуры метанобразующих микроорганизмов получали на следующих питательных средах (г/л):

KH₂PO₄-0,38; Na₂HPO₄-0,53; NH₄CL-0,30; NaCL-0,30; CaCl₂* 2H₂O-0,11; MgCL₂*6H₂O-0,10; резазурин - 0,001; (индикатор восстановительных условий); раствор микроэлементов – 1,0 мл/л; витамины – 0,5;

Для получения чистых культур метаногенов использовали рассев накопительной культуры на поверхность или в толщю агаризованной минеральной среды того же состава (с 1,5-2% агара). Стерильную анаэробную агаризованную среду в плотно закупоренных сосудах расплавляли, остужали до 45°С и стерильным шприцем вносили аликвоту культуральной жидкости из накопительной культуры с соблюдением условий анаэробиоза. Культивирование осуществляли в термостатируемом шейкере-инкубаторе со скоростью вращения 180 об/мин при температуре 37°С.

Культурально-морфологические признаки выделенных чистых культур (размер, форму клеток, оптические свойства, цвет) изучали по общепринятой методике Н.С. Егорова [3]. Тинкториальные свойства определяли окраской по Граму [4].

Выделение ДНК проводили по методу К. Вильсон. Концентрацию выделенной ДНК замеряли на приборе NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, USA) ПЦР с праймерами на 16S rRNA.

Подбор оптимальных условий культивирования выделенных метаногенных бактерий проводили методом посева на жидкую питательную среду «П» с разными значениями рН (5,5-7,0; 6,2-6,8; 7,5-8,0) и процесс культивирования вели при разных температурах (15°С; 37°С; 50°С). Оптическую плотность клеток измеряли на спектрофотометре при длине волны 540 нм.

Результаты эксперимента и их обсуждения

Выделение чистых культур ацидофильных микроорганизмов из навоза КРС. Для получения чистых культур метаногенов использовали рассев накопительной культуры на поверхности или в толщу агаризованной среды в анаэробных условиях. При выделении из накопительных сред анаэробных метаногенов на 5 сутки при рН 6,5-7,5 из пробы №3 обнаружены однородные, подвижные палочки. В остальных накопительных средах №1 и №2 при микроскопировании не обнаружено наличия микроорганизмов в исследуемых образцах.

В накопительной жидкой среде в пробах №4, №5 и №6 микроорганизмы были пересеяны на чашки Петри с твердой агаризованной средой в плотно закупоренных сосудах при рН=6,8. Культивирование производили при t=37⁰С. На 7 сутки инкубационного периода на агаризованной среде появились отдельные колонии и при микроскопировании отмечено неподвижные коккообразные формы клеток.

В чашках Петри пробы №7 и №8 обнаружены мелкие колонии, имеющие вид палочек с закругленными краями, разного размера. Колонии белого цвета представлены крупными овальными клетками, по форме напоминающие дрожжи. Для выделения чистой культуры были произведены пересевы отдельных колоний в жидкую минеральную и агаризованную среды. Культивирование на жидкой среде осуществлялось при t=37 ⁰С и в качальках 220 об/мин в течение 7 суток. В результате на 5 сутки инкубирования рН жидкой среды снизился с 6,7 до 4,2. При понижении рН в пробах №7 и №8 рост метаногенов не обнаружены.

При глубинном посеве на твердой агаризованной среде в пробах №9 и №10 обнаружены отдельные мелкие колонии. В микроскопической картине показаны коккообразные формы клеток.

Для выделения чистых культур использовали твердую агаризованную питательную среду с дрожжевым экстрактом. На 5 сутки роста культуру (проба №3) из накопительной среды пересеяли на твердую агаризованную среду. На 7 сутки роста отмечено появление очень мелких прозрачных, S-формы колоний, размером 1-2 мм. Отдельные колонии пересеяли на скошенную агаризованную среду с дрожжевым экстрактом (7-суточную культуру после накопления биомассы заложили на хранение при температуре 4-8С).

Рисунок 1 – Микроструктура изолята №3 выделен из свежего навоза КРС

Рисунок 2 – Микроструктура изолята №5 выделен из свежего навоза КРС

Определение чистоты выделенных культур. Чистоту выделенных культур метаногенных микроорганизмов в пробах №3 и №5 определяли на средах: сусло-агар, МПБ, среда Чапека. Через 3-е суток в пробах №3 рост посторонней микрофлоры не отмечен, в пробах №5 на средах сусло-агар, МПБ, среда Чапека обнаружено наличие мицелиальных грибов. Изоляте №5 работа по выделению чистых культур продолжаются.

Описание выделенных изолятов. Изолят №3 выделен из полужидкого навоза с влажностью 90% . Мелкие грамотрицательные палочковидные клетки, эндоспор не образует, строгий анаэроб, неподвижные. Оптимальная температура для роста 37°С. Энергию получает путем восстановления СО₂ до СН₄,используя в качестве доноров электронов Н₂. Хорошо растет на жидкой питательной среде с дрожжевым экстрактом. Оптимальная условия для роста – температура 35-40°С и рН 6,8.

Изолят №4 выделен из свежего навоза КРС. Очень строгий анаэроб. Кокки неправильной формы. Грамотрицательные. Субстратами для образования СН₄служат Н₂ и СО₂. Источником азота служит аммиак, источникос серы – сульфид.Оптимальная условия для роста – температура 40°С и рН 6,6.

Изолят №5 выделен из полужидкого навоза КРС. Крупные палочки, подвижные, 0,9×1,8-3,0мкм. Грамотрицательные палочки, эндоспор не образует. Энергию получает путем восстановления СО₂ до СН₄,используя в качестве доноров электронов Н₂. Ацетат, метиламины и метанол не используют. Оптимальная температура роста 37ºС и рН 6,1-6,9.

Изолят №6 выделен из руды с карьера Бестобе. Грамотрицательные палочки, спор не образует. На среде с серой практически не растет. Оптимальная температура для роста 28С. Энергию получает при окислении восстановленных соединений железа. Хорошо растет на жидких средах с Fe²⁺, рН среды снижает до 1,8-1,5.

Изолят №9 выделен из свежего навоза КРС. Очень строгий анаэроб. Кокки неправильной формы. Грамотрицательные. Субстратами для образования СН₄служат Н₂ и СО₂. Источником азота служит аммиак, источникос серы – сульфид.Оптимальная условия для роста – температура 40°С и рН 6,6.

Изолят №10 мелкие грамотрицательные палочковидные клетки, эндоспор не образует, строгий анаэроб, неподвижные. Оптимальная температура для роста 37°С. Энергию получает путем восстановления СО₂ до СН₄,используя в качестве доноров электронов Н₂. Хорошо растет на жидкой питательной среде с дрожжевым экстрактом. Оптимальная условия для роста – температура 35-40°С и рН 6,8.

Идентификация метаногенных микроорганизмов методом ДНК- секвенирования. Предварительно по культурально-морфологическим признакам изоляты №3 и №5 были отнесены к классу Methanococcus и Methanopyrus.

Сравнительный анализ 16S rRNA нуклеотидных последовательностей изолятов №3 и №5 с секвенсами других организмов через GenBank NCBI.

Идентификация выделенных штаммов с использованием сиквенс-анализа генов 16S rRNA согласуется с результатами, полученными при изучении культурально-морфологических признаков. По данным нуклеотидных последовательностей 16S rRNA изолят №3 подтверждают видовое наименование Methanococcus deltae, изолят №5 к роду Methanopyrus с 99-100% идентичностью.

Таким образом, в результате проведенных исследований получены из накопительных культур анаэробные микроорганизмы, выделены чистые культуры метаногенных анаэробных микроорганизмов, изучены культурально - морфологические и физиологические свойства выделенных анаэробных бактерий, проведена молекулярно-генетическая идентификация выделенных штаммов и определено таксономическое положение активных метаногенных бактерий.

Литература

1. Ковалев А.А., Левчикова М.В., Лосяков В.П. Система нагрева жидкого навоза в биогазовых становках. В кн. Электрификация сельского хозяйства. – Москва, 1990. – Т. 74. – С. 154–163.

2. Madigan M.T., Marrs B.L. Extremophiles // Sci. Amer. 1997. V. 4. P. 82–87.

3. Егоров Н. С. Практикум по микробиологии // Изд. Моск. Унив. 1976. С. 126-129.

4. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М и др. Практикум по микробиологии // М. 2005. С. 77-78.

 

6

 

Код для цитирования: Скопировать