X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2018

Введение

Сегодня все чаще поднимается вопрос о необходимости перехода от традиционных упаковок к биоразлагаемым. Это связано, в первую очередь, с экологическими проблемами, которые влечет использование обычных упаковок. Наиболее перспективной заменой полиэтилену становятся природные полимеры, такие как хитозан, пектин, казеин, которые являются легко возобновляемым источников сырья, способны к биодеградации и уникальному комплексу свойств. Полимеры молочной кислоты, например, в присутствии некоторых микроорганизмов разлагаются на диоксид углерода и воду.

Биополимеры используют при создании технологии водоочистки, переработки различных видов техногенных отходов, в медицинских целях и др. Перспективным направлением является разработка биодеградируемых полимерных материалов на их основе, обладающих антибактериальными свойствами.

Основным принципом создания экологически безопасных полимерных оболочек является использование в качестве основы природных высокомолекулярных соединений животного и растительного происхождения. Продукты деструкции данных материалов легко включаются в процессы метаболизма природных биосистем, являющихся питательной средой для микроорганизмов. Эти продукты используются для обогащения почв.

Установлено, что полученные полимерные пленки полностью биоразлагаемы. Изучен микробиологический состав деструкторов, антибактериальные свойства пленок.

Глава 1. Методика антибиотикочувствительности

Выявив оптимальное соотношение компонентов биоразлагаемых пленок на основе хитозана, пектина и казеина была проведена методика антибиотикочувствительности для оценки влияния антибиотиков на процесс биодеструкции полученных полисахаридных пленок. Компоненты пленок подбирали, варьируя их процентное содержание для получения биодеградируемой пленки с наилучшими показателями (целостная структура, пластичность, способность отделяться от носителя, прозрачность).

Для оценки влияния микроорганизмов на процесс биодеструкции был применен диско-диффузионный метод или метод бумажных дисков чувствительности к антибиотикам. Были выбраны антибиотики широкого спектра действия тетрациклинового ряда.

Для всех тетрациклинов характерен широкий спектр антимикробного действия. Они высокоактивны в отношении большинства грамположительных и грамотрицательных бактерий. Тетрациклины в обычно применяемых концентрациях действуют бактериостатически на внеклеточно и внутриклеточно расположенных возбудителей. Бактерицидное действие оказывают только при высоких концентрациях антибиотиков. Молодые, быстро размножающиеся культуры более чувствительны к действию препаратов, чем находящиеся в фазе покоя. Устойчивость микроорганизмов к тетрациклинам развивается медленно, по пенициллиновому типу. Микробы, резистентные к одному из тетрациклинов, обладают перекрестной устойчивостью к другим антибиотикам этой группы.

Выбор был сделан в пользу тетрациклина и доксициклина. Тетрациклин - антибиотик природного происхождения. Доксициклин - антибиотик полусинтетического происхождения, имеет преимущества по сравнению с природными антибиотиками тетрациклинового ряда. Описание антибиотиков дано в приложение 1.

Были приобретены антибиотики в таблеточной форме в концентрации 100 мг действующего вещества. Таблетки измельчались механическим путем и разводились дистиллированной водой до 1% концентрации действующего вещества. Бумажные диски с диаметром 0,5 мм были вымочены в 1% растворах данных антибиотиков.

Затем был произведен посев воздуха. В качестве культивируемой среды был использован мясо-пептонный агар (МПА) на чашках Петри. На эту питательную среду были помещены полученные полимерные пленки. Затем был сделан посев воздуха в учебной аудитории на полученную питательную среду – открывали чашки Петри и оставляли на 5 минут. После этого на образцы пленок были помещены бумажные диски, пропитанные раствором антибиотиков. Далее закрытые чашки Петри помещали в термостат при температуре 27 °С на 7 суток.

Глава 2. Изучение образовавшихся колоний после осуществления посева воздуха

В чашки Петри на питательную среду МПА были помещены следующие образцы пленок:

Хитозан + тетрациклин; Хитозан - контроль; Хитозан : пектин (50 : 50) + тетрациклин; Хитозан : пектин (50 : 50) - контроль; Хитозан : пектин (50 : 50) + доксициклин; Пектин : казеин (50 : 50) + тетрациклин;

Пектин : казеин (50 : 50) + доксициклин; Пектин : казеин (50 : 50) - контроль; Хитозан : казеин (70 : 30) + доксициклин; Хитозан : казеин (70 : 30) + тетрациклин; Хитозан : казеин (70 : 30) - контроль; Контроль.

По истечении 7 суток чашки Петри вынули из термостата и произвели подсчет образовавшихся колоний (рис 1). Затем чашки Петри с образцами были оставлены в темном месте при комнатной температуре еще на 7 суток. По истечении данного времени также был произведен подсчет образовавшихся колоний (рис. 1).

Рис. 1. Количество образовавшихся колоний на образце №5 по истечении 7 и 14 суток соответственно

Полученные после 14 суток колонии были пересеяны в пробирки на скошенную питательную среду МПА микробиологической петлей для получения чистых культур (рис. 2). Выдерживались в термостате 7 суток при температуре 27 °С. Полученные колонии микромицетов приведены в приложение 2, 3. С выращенных культур, готовили фиксированные препараты и рассматривали под микроскопом (рис. 3). Для установления родового и видового состава пользовались определителем для грибов.

Рис. 2. Колония микромицетов на скошенной питательной среде МПА

Рис. 3. Фиксированный препарат колонии микромицетов под микроскопом

Проанализировав полученные колонии микроорганизмов и их количество в контрольных образцах и образцах содержащих антибиотики можно выделить некоторые закономерности. В контрольном образце № 12, содержащим только питательную среду МПА по истечении 14 суток не было обнаружено ни одной колонии.

В контрольных образцах (№ 2, 4, 8, 11), не содержащих антибиотики, количество образовавшихся колоний гораздо меньше. Также нужно отметить, что помимо микромицетов, обнаружены бактериальные колонии.

В образцах, содержащих диски, пропитанные антибиотиками число колоний микромицетов гораздо больше, бактериальных колоний не обнаружено. Существенных отличий между колониями, содержащими тетрациклин, и доксициклин не обнаружено. Т.е. бактерии, образовавшие колонии в контрольных образцах не обладают устойчивостью к данным антибиотикам.

После микробиологического исследования полученных колоний были идентифицированы следующие микромицеты:

Penicillium sp. 1; Penicillium sp. 2; Aspergillus niger; Penicillium palitans; Aspergillus sp. 1; Aspergillus sp. 2; Aureobasidium pullulans; Cladosporium sp.; Alternaria sp.; Aposphaeria sp..

Описание микромицетов, осуществляющих процесс биодеструкции приведено в приложение 4.

Данный эксперимент показывает, что полученные образцы пленок легко и быстро разлагаются в окружающей среде. С помощью антибиотиков были подавлены микроорганизмы, участвующие в процессах биодеструкции пленок, полученных из биологически активных полимеров. Таким образом, в процесс разложения были вовлечены группы микромицетов, быстро справляющихся с утилизацией полученных комплексов полимеров, не нанося урон окружающей среде и быстро включая их в круговорот веществ.

Глава 3. Определение антибактериальных свойств полученных образцов пленок

Для оценки антибактериальных свойств полученных пленок в состав образцов был добавлен раствор йода разных концентраций.

Соединения на основе йода широко применяются для различных целей. Наиболее часто используют водные и спиртовые растворы элементарного йода в качестве антисептического средства. Йод подавляет рост и действует бактерицидно на различные группы микроорганизмов. Основное преимущество йода состоит в том, что он убивает не только вегетирующие, но и споровые формы микроорганизмов. Высокая токсичность йода существенно ограничивает применение элементарного йода в медицинской практике, однако уникальность широкого спектра антимикробного действия стимулирует поиски соединений йода, обладающих меньшей токсичностью при сохранении антимикробных свойств. Нами предпринята попытка уменьшить его токсичность за счет комплексообразования с полученными пленками.

Методика изучения активности исследуемых образцов на плотных питательных средах была идентичной определению антибиотикочувствительности диско-диффузионным методом. Исследования были проведены на микроорганизме стафилококк золотистый (Staphylococcus aureus) - шаровидная грамположительная бактерия рода стафилококк, которую часто находят на коже людей. Этот микроорганизм является одной из четырех наиболее вероятных причин внутрибольничных инфекций, часто вызывая послехирургические раневые инфекции. Диапазон вызываемых им заболеваний простирается от кожных, респираторных, костных, суставных и эндоваскулярных.

Для получения антимикробных комплексов были использованы растворы йода и йодида калия в соотношении 1:3 со следующими концентрациями в составе пленок: 0,5%, 1%. В качестве контроля использовали аптечный препарат «Йодинол» в концентрации 0,5%, 1 %.

Результаты чувствительности Staphylococcus aureus диско-диффузионным методом на среде МПА представлены в табл. 1.

Таблица 1

Интерпретация чувствительности Staphylococcus aureus диско-диффузионным методом на среде МПА

Состав пленки	Концентрация йода, %	Диаметр зоны задержки роста, мм
		˂10	10-15	15-25	˃25
Хитозан:пектин 70:30	0,5			+
Хитозан:пектин 50:50	1				+
Контроль: препарат «Йодинол»	0,5		+
	1			+

Как видно из данных, представленных в таблице, комплексы с иммобилизованным йодом превосходят по своей эффективности препарат «Йодинол» по отношению к Staphylococcus aureus.

Заключение

В настоящее время все чаще поднимается вопрос о необходимости перехода от традиционных упаковок к биоразлагаемым. Это связано, в первую очередь, с экологическими проблемами, которые влечет использование обычных упаковок.

Основным принципом создания экологически безопасных полимерных оболочек является использование в качестве основы природных высокомолекулярных соединений животного и растительного происхождения. Продукты деструкции данных материалов легко включаются в процессы метаболизма природных биосистем, являющихся питательной средой для микроорганизмов.

Сегодня разработка биодеградируемых полимеров считается одной из самых приоритетных задач и с точки зрения экономической целесообразности утилизации, и с точки зрения охраны окружающей среды.

Проанализировав в ходе нашего исследования большое количество показателей и свойств пленок, полученных на основе биологически активных полимеров была рассмотрена возможность использования их в бытовых и промышленных целях. Полученные экспериментальные образцы плёнок предположительно могут быть использованы в качестве экологически безопасного упаковочного материала и служить альтернативой полиэтиленовой упаковки. Могут быть использованы в медицине, т.к. обладают антибактериальными свойствами и способностью к биодеструкции.

Список литературы

Агеев, В.П. Получение и свойства пленок хитозана и пленок полиэлектролитных комплексов хитозана и карбоксиметилхитина / Е.П. Агеев и [др] // Высокомолекулярные соединения. – 1998. – Т.40А. - №7. – С.1198-1204.

Варламов, В.П. Хитин и хитозан: природа, получение и применение / В.П. Варламов, С.В. Немцев, В.Е. Тихонов. – Российское хитиновое общество, 2010. – 292 с.

Градова, Н.Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии / Н.Б. Градова. - М., 2004. - С. 94-98.

Досон, Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот. - М.: Мир, 1991.- 544 с.

Леонов, Н.Р. Практикум по микробиологии / Н.Р. Деонов. - М.: Агропромиздат, 1988.- 160 с.

Опарина, С.А. Получение полисахаридных пленок и изучение их способности к биодеструкции / С.А. Опарина, Н.И. Морозова // Молодой ученый. – 2016. – №4. – С. 194-197.

Сафронова, Т.М. Применение хитозана в производстве пищевых продуктов: Хитин, его строение и свойства / Т.М. Сафронова // Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение. – М.: Наука, 2002. – C.346-359.

Приложение 1

Характеристика антибиотиков, использованных при микробиологическом посеве

Признаки	Характеристика
Наименование Фармакологическое действие Форма выпуска Условия хранения Синонимы	Тетрациклина гидрохлорид (Tetracyclini hydrochloridum) Тетрациклина гидрохлорид отличается от тетрациклина (основания) лучшей растворимостью в воде. Может применяться внутримышечно, для введения в полости, местно, а также внутрь. Таблетки по 0,1 и 0,25 г. Сухое вещество для внутримышечного применения во флаконах по 0,1 г. Сухое вещество для внутривенного применения во флаконах во флаконах. Список Б. В сухом, защищенном от света месте при комнатной температуре. Амбрамицин, Амрацин, Польфамицин, Тетрациклин хлористоводородный. Смотрите также список аналогов препарата Тетрациклина гидрохлорид.
Наименование Фармакологическое действие Форма выпуска Условия хранения Синонимы	Доксициклин (Doxycyclinum) Полусинтетический антибиотик группы тетрациклина широкого спектра действия. Оказывает бактериостатическое действие. Активен в отношении грамположительных микроорганизмов: Аэробных кокков - Staphylococcus spp. (в том числе продуцирующих пенициллиназу), Streptococcus spp., в том числе Streptococcus pneumoniae. Аэробных спорообразующих бактерий - Bacillus anthracis; аэробных неспорообразующих бактерий - Listeria monocytogenes; анаэробных спорообразующих бактерий - Clostridium spp. Препарат активен так же в отношении грамотрицательных микроорганизмов: Аэробных кокков - Neisseria gonorrhoeae. Аэробных бактерий - Escherichia coli, Shigella spp., Salmonella spp., Enterobacter spp., Klebsiella spp., Bordetella pertussis. Препарат активен также в отношении Rickettsia spp., Treponema spp., Mycoplasma spp. и Chlamydia spp. К препарату устойчивы Pseudomonas aeruginosa, Proteus spp., Serratia spp., большинство штаммов Bacteroides fragilis. Капсулы - 10 штук в блистере, 1 блистер в картонной упаковке. Препарат следует хранить при температуре не выше 25 °C. Срок годности - 3 года. Вибрамицин, Доксициклина гидрохлорид, Абадокс, Биоциклинд, Биостар, Доксацин, Доксиграм, Доксилен, Доксимоиин, Доксипан, Доксилин, Экстрациклина, Изодокс, Ламподокс, Микромииин, Минидокс, Новациклин, Сарамицина, Синкромицин, Вибрабиотик, Вибрацина, Вибрадоксил, Юнидокс Солютаб, Доксинат, Этидоксин, Супрациклин, Ало Докси, Доксибене, Медомицин.

Приложение 2

Колонии образовавшихся микроорганизмов на пленках, полученных из биологически активных полимеров

По истечении 7 суток
Хитозан : пектин (50 : 50) + тетрациклин	Хитозан : пектин (50 : 50) + доксициклин
Пектин : казеин (50 : 50) + тетрациклин	Хитозан : пектин (50 : 50) - контроль
Хитозан : казеин (70 : 30) - контроль	Хитозан : казеин (70 : 30) + доксициклин
Пектин : казеин (50 : 50) + тетрациклин	Хитозан : казеин (70 : 30) + тетрациклин
Пектин : казеин (50 : 50) - контроль	Хитозан + тетрациклин

Приложение 3 Колонии образовавшихся микроорганизмов на пленках, полученных из биологически активных полимеров По истечении 14 суток
Хитозан : пектин (50 : 50) + доксициклин	Хитозан : казеин (70 : 30) + доксициклин
Пектин : казеин (50 : 50) + доксициклин	Хитозан : пектин (50 : 50) + тетрациклин
Пектин : казеин (50 : 50) + тетрациклин	Хитозан : казеин (70 : 30) + тетрациклин
Хитозан + тетрациклин	Пектин : казеин (50 : 50) + тетрациклин

Приложение 4

Описание микромицетов, осуществляющих процесс биодеструкции пленок из биологически активных полимеров

Название	Характеристика
Penicillium	Род плесневых грибов, образующихся на продуктах питания и вследствие этого портящих их. Естественной средой обитания пеницилла является почва. Пеницилл часто можно увидеть в виде зелёного или голубого плесневого налета на разнообразных субстратах, в основном, растительных. Вегетативный мицелий пеницилла ветвящийся, прозрачный и состоит из множества клеток. От гифов отходят прямостоячие или приподнимающиеся конидиеносцы. Размножение пеницилла происходит с помощью спор.
Aspergillus	Род высших аэробных плесневых грибов, распространённых по всему миру в различных климатических условиях. Аспергиллы хорошо растут на различных субстратах, образуя плоские пушистые колонии, вначале белого цвета, а затем, в зависимости от вида, они принимают разную окраску, связанную с метаболитами гриба и спороношением. Мицелий гриба очень сильный, с характерными для высших грибов перегородками. Аспергиллы распространяются спорами.
Aureobasidium	Имеют слабо развитый мицелий, вначале бесцветный, позже темный. Гифы состоят из цепочек темных, толстостенных клеток, от которых отпочковываются одноклеточные, овальные или эллипсоидные конидии. Принимают участие в ряде основных превращений веществ, которые совершаются в почве.
Cladosporium	Это род грибов, в том числе некоторые наиболее распространенные крытые и открытые формы. Виды оливково-зеленые до коричневых или черных колоний, и есть темно-пигментированные конидии, образующие простые или ветвящиеся цепочки. Многие виды обычно встречаются на живых и мертвых растительных материалах. Некоторые виды фитопатогенов, другие паразитируют на других грибах. Споры распространяются ветром и они часто встречаются в воздухе. В помещении могут расти на поверхности, когда присутствует влага.
Alternaria	Широко распространены в окружающей среде и являются естественной частью грибковой флоры практически везде. Они являются агентами распада и разложения. Споры встречаются в воздухе, в почве и воде, а также в помещениях и на объектах. Имеют булавовидные споры одиночные или образуют длинные цепи. Они могут расти густыми колониями, которые, как правило, имеют зеленый, черный, или серый цвет.

Чистые культуры микромицетов на скошенной питательной среде МПА

Penicillium sp. 1	Aspergillus sp. 1
Aspergillus sp. 2	Aspergillus niger
Penicillium palitans	Penicillium sp. 2

Код для цитирования: Скопировать