X Международная студенческая научная конференция
«Студенческий научный форум» - 2018
 
     

МЕТОД ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ И НАСЛЕДСТВЕННЫХ ПАТОЛОГИЙ
Филиппенок В.В.
Текст научной работы размещён без изображений и формул.
Полная версия научной работы доступна в формате PDF


ВВЕДЕНИЕ

Каждый вид микроорганизмов, растений или животных имеет уникальный набор хромосом. Они образованы ДНК – дезоксирибонуклеиновой кислотой. Мелкие фрагменты ДНК называются нуклеотидами, а их определенная последовательность составляет ген. Каждый ген кодирует синтез одного белка. Последовательность нуклеотидов уникальна. Для каждого вида живых организмов существуют общие участки ДНК, отвечающие за однообразие в пределах этого вида.

Анализ ДНК нескольких сотен микробов, попавших в материал для исследования, не позволит выявить видовые закономерности. Необходимо во много раз увеличить количество значимых генетических компонентов, что даст возможность их идентифицировать. Эту задачу решает метод ПЦР.

Современные высокотехнологичные методы лабораторного исследования позволяют определить болезни на начальной стадии. Инфекционные заболевания развиваются и эволюционируют, их становится все больше, а выявить их все сложнее. Диагностика методом ПЦР (полимеразная цепная реакция) является одной из самых новейших и высокоточных. Большинство врачей сталкиваются с этим анализом ежедневно и уже не представляют, как без него возможно поставить правильный диагноз и стадию болезни. За ее разработку ученый Кэри Мюллис был награжден Нобелевской премией.

Цель: изучить основу метода ПЦР-диагностики, применение метода, его преимущества и недостатки, ход исследования.

Задачи:

1)Понять суть метода ПЦР-диагностики;

2)Изучить ход исследования,

3)Рассмотреть плюсы и минусы метода;

4)Определить области применения ПЦР исследования.

ОСНОВА МЕТОДА

Полимеразная цепная реакция – метод молекулярно-генетической диагностики, позволяющий найти у людей разные виды инфекционных и наследственных патологий, как в острой и хронической форме, так и задолго до того, как патология начинает себя проявлять.

При проведении анализа ПЦР используются специальные ферменты, многократно копирующие фрагменты РНК и ДНК, а также микроорганизмы, возбуждающие заболевания и находящиеся в биологических материалах человека. Копирование происходит в несколько этапов, поэтому образуется цепная реакция. После этого специалисты лаборатории делают сверку полученных данных с общей базой и выявляют возбудителей заболевания, а также их концентрацию. Диагностику проводят в специальном приборе, который производит охлаждение и нагревание пробирки с биоматериалом и называется амплификатор. Соблюдение температурного режима влияет на правдивость результатов анализа.

Фрагменты ДНК микроорганизмов могут содержаться в следующих биологических материалах:

  • биологические жидкости;

  • кровь и ее производные;

  • соскоб эпителиальных клеток или мазок;

  • моча;

  • мокрота;

  • слизь и другие биологические выделения;

  • биопаты слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта.

Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПЦР

Диагностика инфекционных заболеваний с применением полимеразной цепной реакции велика, с ее помощью можно определить самые разнообразные вирусы, вызывающие такие инфекции как:

-ВИЧ – ПЦР-диагностика ВИЧ очень эффективна для обнаружения вируса, который вызывают эту болезнь, блокирует защитные функции и открывает путь в организм человека всевозможным патологиям;

-герпес – диагностика герпеса методом ПЦР может обнаружить вирус у человека только во время рецидива, этот способ позволяет установить какого он типа;

-мочеполовые инфекции – ПЦР-диагностика урогенитальных инфекций (хламидиоз, уреаплазмоз, гарднереллез, микоплазмоз, трихомониаз, кандидоз и прочие) на сегодняшний день активно применяется, так как определить возбудителей ИППП с помощью традиционных анализов сложно, а диагностика инфекций методом ПЦР позволяет в минимальной пробе выявить наличие патогенных микроорганизмов и вовремя начать терапию;

-гепатит – диагностика гепатита методом ПЦР является одним из важнейших шагов для определения причин его появления и назначения адекватной схемы лечения, без использования современных молекулярно-биологических методов поставить адекватный диагноз данной патологии невозможно;

-листериоз – ПЦР-диагностика позволяет выявить даже единичных возбудителей данного заболевания в кратчайшие сроки;

-цитомегаловирус – ПЦР-диагностика этого заболевания считается прогрессивной, но не дает возможность определить является ли инфекция первичной или повторной, другими словами не различает активный вирус от спящего;

туберкулез – ПЦР-диагностика туберкулеза помогает выявить наличие активной формы патологии в несколько раз оперативнее, чем другие исследования, также можно осуществлять эпидемиологический контроль за бактериовыделителями на фоне кажущейся стабилизации состояния больного. Для диагностики туберкулеза у детей делают пробу Манту, если она положительная, то метод ПЦР позволяет с высокой точностью подтвердить установленный диагноз и определить не только туберкулез легких, но и поражение этим вирусом кожи, почек, кишечника и других органов;

-вирус папилломы человека – ПЦР-диагностика ВПЧ используется для определения его типа и помогает определить количественные и качественные характеристики вируса;

-клещевой энцефалит – результаты ПЦР при определении хронической формы заболевания являются самыми надежными;

-глистная инвазия – диагностика паразитов помогает выявить инвазии простейшими, а также внутриклеточными паразитами, но он не позволяет определить степень тяжести заражения и количество вредителей в организме;

-хеликобактерная инфекция – с помощью метода ПЦР возможно определение высокопатогенных и низкопатогенных штампов Хеликобактер Пилори, это важно для прогноза заболевания и эффективной терапии.

Беременным женщинам назначают анализ ПЦРК, чтобы выявить инфекции, передающиеся половым путем, значительно увеличивающие риск появления рака шейки матки, пагубно влияющие на протекание беременности и здоровье ребенка. Поэтому крайне важна диагностика ЗППП, чтобы не допустить заражение плода патогенными микроорганизмами.

ХОД ИССЛЕДОВАНИЯ

Процесс анализа состоит из нескольких фаз, каждая из которых требует определенного времени и температурного режима. В течение нескольких часов из тысячной доли грамма ДНК бактерий получается нужное количество материала для анализа. Современная аппаратура дает возможность многократно копировать ДНК даже одной клетки, например, сперматозоида.

Этапы анализа:

  • взятие биологического материала (крови, мочи, влагалищных выделений, слюны и так далее) у пациента и доставка в лабораторию;

  • разделение двух нитей ДНК, переплетение которых образует хромосому, и очищение их от посторонних примесей;

  • удвоение нужного участка нити ДНК, в результате ее количество растет в геометрической прогрессии;

  • обработка полученного материала растворами, вызывающими специфическое свечение полученных фрагментов ДНК, по этому окрашиванию распознают, какая бактерия или вирус были в источнике; для разделения фракций ДНК используют электрофорез.

Длительность анализа составляет 4-5 часов.

Подготовка к исследованию

Для достоверности результатов необходимо соблюдать правила по предварительной подготовке к анализу:

  • при сдаче слюны нельзя кушать и пить медикаменты за четыре часа до анализа, перед процедурой надо промыть рот кипяченой водой, после этого провести небольшой массаж кожи для того, чтобы выделился секрет из железы;

  • мочу как правило собирают дома. Перед этим необходимо помыть половые органы и собрать в специальный контейнер 50 мл первой утренней мочи, нецелесообразно собирать материал при менструации;

  • перед сдачей спермы мужчине нужно трое суток не вступать от половую связь, не посещать сауну, не купаться в горячей ванне, не принимать алкогольные напитки и острую еду. Непосредственно перед анализом запрещено мочиться три часа;

  • для сдачи урогенитального мазка рекомендовано отсутствие половых связей на протяжении трех суток. За две недели до анализа запрещен прием антибактериальных лекарств. За неделю надо перестать пользоваться интимными гелями, мазями, влагалищными свечами, не делать спринцевание. Три часа до взятия биоматериала необходимо воздерживаться от похода в туалет.

  • кровь сдается в утреннее время на голодный желудок.

ПРЕИМУЩЕСТВА И НЕДОСТАТКИ АНАЛИЗА ПЦР

Полимеразная цепная реакция обладает такими преимуществами перед традиционными способами определения возбудителей инфекции:

-большая чувствительность теста позволяет определить даже единичные агенты возбудителя, что дает возможность выявить патологию на ранней стадии, при хронической и скрытой форме;

-универсальность метода позволяет использовать почти любой биоматериал для исследования от слюны до клеток кожи;

-большой охват – при исследовании одного образца возможно определить наличие нескольких разных возбудителей заболеваний;

-точность – высокий уровень этого метода обследования позволяет не выдавать ложных показателей;

-скорость – результат готов в среднем за пять часов, то есть пациент на другой день после сдачи биоматериала уже может забрать заключение;

-относительно невысокая цена – данный метод диагностики по стоимости не отличается от других лабораторных анализов крови;

-используя этот метод, можно сделать доклиническую и ретроспективную диагностику. Первая выявляет патогенные микроорганизмы еще до проявления заболевания, а вторая проводится после перенесенной патологии, что позволяет не дать патологии развиться и вовремя ее вылечить, а также определить латентную форму заболевания, протекающую без явных симптомов.

Недостатки анализа

Минусы ПЦР связаны в основном с ее технической сложностью:

-необходимо правильно выбрать последовательности РНК – праймеры, а также приготовить смесь нуклеотидов для синтеза ДНК;

-метод очень чувствителен, поэтому если в образце есть разные виды микробов, он может давать неверные результаты;

-нужно тщательно очищать анализируемый материал от примесей белков человека и лекарств, так как они снижают точность диагностики;

-требуется контрольное сравнение результатов с образцами, заведомо содержащими или не содержащими материал микроорганизмов, а также вообще не включающими ДНК для определения ошибок и загрязнений.

Ложноотрицательные результаты ПЦР вызваны нарушением техники анализа и изменениями в генетической последовательности любого из компонентов реакции. Встречаются и ложноположительные данные – при случайном совпадении нуклеотидов праймеров и других применяемых реактивов с одним из генов микроорганизма

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ПЦР-диагностика инфекций невероятно точна — она позволяет обнаружить возбудителя болезни, даже если в пробе находится всего одна-единственная молекула его ДНК. Именно это качество сделало ПЦР-анализ одним из эффективнейших диагностических инструментов как для определения наличия инфекции, так и для контроля за ходом лечения.

Можно сделать вывод, что лабораторная диагностика с применением метода ПЦР помогает врачу установить точный диагноз и назначить эффективную терапию в каждом индивидуальном случае. Перспективы применения ПЦР-реакции и ее разновидностей в медицине и биологии захватывают воображение – от испытания новых лекарств на генном уровне до создания трансгенных организмов с заданными свойствами. Работы в этом направлении ведутся в крупнейших лабораториях мира, что помогает совершенствовать метод ПЦР и на прикладном уровне, для диагностики инфекционных болезней человека.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
  1. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. — 589 с.,

  2. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. — 496 с.;

  3. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы — М.: Наука, 2005 — В 2 т.