X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2018

Цель работы - подобрать оптимальную среду высушивания для рода Listeria.

В работе использован штамм L. monocytogenes MD из коллекции 1960-1970 гг.

Начальным этапом при лиофилизации бактерий является накопление бактериальной массы на плотных или жидких питательных средах.

Изучаемый штамм рода Listeria имеет температурный оптимум роста 25-37°С, непривередлив к составу питательных сред [1-9]. В связи с этим в качестве среды накопления был выбран мясопептонный агар (МПА).

Готовили суточную культуру бактерии, затем бактериологической петлей делали посевы штрихом (т.к. нанесение культуры штрихом более удобно, можно наблюдать культуральные свойства отдельных колоний, а так же стерильность культуры, при посеве газоном сливной рост не позволяет выявить постороннюю контаминацию) на МПА. Чашки Петри инкубировали в термостате 24 часа при 37°С.

Через сутки наблюдали чистые колонии без посторонней контаминации.

После суточного инкубирования чашек и микроскопии колоний проводили смыв бактериальной массы 4,5 мл МПБ. Для этого бактериологической петлей отслаивали культуру с агара и при помощи пипетки отсасывали получившуюся суспензию бактерий в стерильные пробирки.

По отзывам и рекомендациям из литературы, нами были подобраны компоненты и составлены среды для высушивания.

Стабилизаторы:

1. Сухое обезжиренное молоко (9%), лактоза (5%) , сахароза (5%) на 100 мл Н2О.

2. Лактоза (1%), сорбит (1%), сахароза (3%), желатин (2%) на 100 мл Н2О.

Компоненты для каждой среды смешивали в 100 мл дистиллированной воды, и растворяли на кипящей водяной бане. Стерилизацию проводили автоклавированием при 0,5 атм в течение 25-30 минут. Готовые среды хранили в холодильнике при температуре не выше 10°C.

Так как в процессе лиофилизации погибает большое количество клеток от 30 до 60% рекомендуемая концентрация микробной взвеси должна быть не менее 1 млрд м.к. / мл. (1×10⁹ м.к./мл).

Через 30 минут после отстаивания клеток бактерий с помощью пипетки удаляли надосадок и полученную бактериальную массу смешивали со стабилизатором в пропорции 1:1.

Далее получившуюся суспензию разливали в ампулы по 1 мл, ставили их на предварительную заморозку в холодильную камеру при температуре -45°C на 24 часа.

Достав ампулы из холодильника, переносии их в камеру лиофильной сушки, предварительно положив мини холодильники под нижнюю полку камеры для поддержания еще большей минусовой температуры.

В общей сложности процесс лиофилизации длился 24 часа. Первые 12-14 часов температура возрастала от -45°C до 0°C.

В промежутке времени 15-24 ч. Температура повышалась от 0°C до +18°C.

Досушивание препаратов проводили с помощью инфракрасной лампы для удаления остаточной влаги, доводя температуру датчика до 28°C.

Высушенные препараты запаивали под вакуумом и хранили в условиях бытового холодильника при температуре 4-6°С.

После высушивания и запайки ампул смотрели внешний вид препарата (рис. 2-3).

1. Окраска сухого препарата равномерная.

2. Сокращение объема, по сравнению с исходными ампулами перед высушиванием, не наблюдали.

3. Содержимое всех ампул с высушенным материалом лучше растворялось в первом стабилизаторе.

4. Появление пузырьков на поверхности материала, как результат наличия в замороженной массе некоторого количества жидкости, не наблюдали.

5. Крупную неравномерную пористость в стабилизаторе всех высушенных ампул не обнаружили.

6. Плохое отставание сухой массы от стенок ампулы было проявлено в стабилизаторе под №2.

В результате можно сказать, что по физическим свойствам стабилизатор под №1 лучше. Но для более точного ответа необходима проверка выживаемости культуры после лиофилизации.

Библиографическийсписок:

1. Васильев, Д.А.Разработка параметров количественного определения бактерий видов Listeria monocytogenes и Listeria ivanovii на основе мультиплексной ПЦР в режиме «реального времени» / Д.А. Васильев, Е.Н. Ковалева, Е.В. Сульдина, А.В. Мастиленко // Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 55-летию ВНИИВВиМ «Актуальные вопросы контроля инфекционных болезней животных». Покров. - 2014. - С. 91-96.

2. Разработка системы фаготипирования листерий / Е.Н. Ковалева, Д.А. Васильев, Е.В. Сульдина // Инфекция и иммунитет. – 2014. – сентябрь, специальный выпуск – С. 87-88.

3. Выделение бактериофагов бактерий рода Listeria / Д.А. Васильев, Е.Н. Ковалева, Е.В. Сульдина // Инфекция и иммунитет. – 2014. – сентябрь, специальный выпуск – С. 69-70.

4.Сульдина Е.В. Применение метода молекулярно-генетического анализа для видовой идентификации мяса/Е.В. Сульдина, О.Л. Колбасова, С.В. Мерчина//Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы V-й Всероссийской (с международным участием) студенческой научной конференции. Ульяновск. -2012. -С. 227-231.

5.Сульдина Е.В. Применение метода Real-time PCR для видовой идентификации мясного сырья в мелкоизмельченных полуфабрикатах и готовых мясных продуктах/Е.В. Сульдина, О.Л. Колбасова,С.В. Мерчина//Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы V-й Всероссийской (с международным участием) студенческой научной конференции. Ульяновск. -2012. -С. 236-240.

6.Сульдина Е.В. Определение видовой принадлежности мясного сырья в мелкоизмельченных полуфабрикатах и готовых мясных продуктах методом ДНК-диагностики/Е.В. Сульдина, О.Л. Колбасова, С.В. Мерчина//Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы V-й Всероссийской (с международным участием) студенческой научной конференции. Ульяновск. -2012. -С. 231-235.

7.Сульдина Е.В. Определение видовой принадлежности мяса методом полимеразной цепной реакции в режиме «Реального» времени/Е.В. Сульдина, О.Л. Колбасова, С.В. Мерчина//Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы V-й Всероссийской (с международным участием) студенческой научной конференции. Ульяновск. -2012. -С. 241-244.

8. Гранкина А.С. Идентификация листерий методом ПЦР в режиме реального времени / А.С. Гранкина, Е.В. Сульдина // Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы IX-й Международной студенческой научной конференции. Ульяновск. - 2016. - С. 84-88.

9. Гранкина А.С. Идентификация листерий методом классической ПЦР / А.С. Гранкина, Е.В.Сульдина // Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы IX-й Международной студенческой научной конференции. Ульяновск. - 2016. - С. 89-93.

10. Сульдина Е.В. Выделение листериозных бактериофагов и изучение их основных биологических свойств / Е.В. Сульдина, Е.Н. Ковалева, Б.И. Шморгун, Д.А. Васильев // Аграрный научный журнал. Саратов. - 2015. № 3. С. 37-41.

11. Сульдина Е.В. Фаготипирование листерий / Е.В.Сульдина, Е.Н. Ковалева, Д.А. Васильев // Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов Всероссийский симпозиум с международным участием. Москва - 2014. с. 223.

12. Ковалева Е.Н. Вопросы биоконтроля пищевого листериоза / Е.Н. Ковалева, Д.А. Васильев, Е.В. Сульдина, И.Г. Швиденко, Б.И. Шморгун // Материалы VII Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням с международным участием. Москва. - 2015. с. 157.

13. Сульдина Е.В. Количественное определение патогенных листерий в пищевом сырье и продуктах питания / Е.В. Сульдина, Д.А.Васильев // Материалы Международной научно-практической конференции "Инновации в пищевой технологии, биотехнологии и химии". Саратов. – 2017. - С. 202-204.

14. Сульдина Е.В. Разработка параметров количественного определения патогенных листерий в пищевом сырье и продуктах питания методом Real-Time PCR / Е.В. Сульдина, Д.А.Васильев // Материалы IХ Всероссийской научно-практической конференции с международным участием МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА 2017. Москва. - 2017. - С. 412-413.

15. Сульдина Е.В. Оптимизация эффективности мультиплексной ПЦР-тест-системы для детекции L. monocytogenes и L.ivanovii / Е.В. Сульдина, Д.А.Васильев // Материалы IХ Всероссийской научно-практической конференции с международным участием МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА 2017. Москва. - 2017. - С. 425-426.

16. Гранкина А.C. Идентификация штаммов листерий коллекции 1960-1970 гг. методом ПЦР/ А.C. Гранкина, Е.В. Сульдина // Материалы Международной научной конференции Молодежь и наука XXI века. – Ульяновск. - 2017. - С. 66-71.

17. Ломакин А.А. Дифференциация бактерий видов Bordetella trematum и Bordetella petrii / Ломакин А.А., Мастиленко А.В., Васильева Ю.Б. и др.// Материалы Международной научной конференции Молодежь и наука XXI века. – Ульяновск. - 2017. - С. 83-86.

18. Сульдина Е.В. Выделение бактерий и бактериофагов Yersinia enterocolitica / Е.В. Сульдина, Д.А.Васильев, С.Н. Золотухин // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2017. - № 3 (39). - С. 50-55.

19. Сульдина Е.В. Создание тест-системы на основе бактериофагов для детекции возбудителя пищевого листериоза и мониторинга листериозной инфекции // Молодежный инновационный форум Сборник аннотаций проектов. Ульяновск. - 2016. - С. 353-355.

20. Сульдина Е.В. Листериозные бактериофаги – как средство индикации и идентификации L. monocytogenes. /Сульдина Е.В., Васильев Д.А., Золотухин С.Н. и др. // Материалы Третьей научно-практической конференции с международным участием Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности. - 2016. с. 85.

21. Сульдина Е.В. Основные биологические свойства листериозных бактериофагов / Е.В. Сульдина, Е.Н. Ковалева, Д.А. Васильев // Материалы VI Международной научно-практической конференции Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения. Ульяновск. - 2015. - С. 125-127.

Код для цитирования: Скопировать