X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2018

Микробиологическая дифференциация патогенных для человека и животных видов коринебактерий в настоящее время не представляет серьезной проблемы. Тем не менее, существуют определенные ограничения в дифференциации патогенных и непатогенных штаммов [1]. Среди видов Corynebacterium, особый интерес представляет Corynebacterium ulcerans, патогенные штаммы которого продуцируют дифтерийный токсин. Так D. Taylor et al. (2002) сообщили об изоляции вирулентных штаммов возбудителя от домашних кошек [2]. У человека, чаще всего, наблюдаются клинические симптомами фарингита, однако не редки случаи поражения вирулентными штаммами C. ulceransс развитиемхарактерных симптомов, схожих с классической дифтерией [3]. Это объясняется наличием в хромосоме возбудителя генов умеренного конвертирующего ß-профага, названного коринефагом, и несущим оперон дифтерийного токсина.

Цели и задачи

Нами была поставлена цель разработать систему детекции патогенных штаммов C. ulceransс применением метода ПЦР в режиме «реального времени». Для этого были поставлены следующие задачи: 1) Провести анализ и выравнивание нуклеотидных последовательностей гена дифтерийного токсина и его регулятора; 2) Провести подбор олигонуклеотидов для их детекции; 3) Оптимизировать программу амплификации фрагментов гена дифтерийного токсина и его регулятора

Материалы и методы

Работа была выполнена в лаборатории молекулярно-генетических исследований кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской ГАУ им П.А. Столыпина.

В работе были использованы штаммы C. ulcerans, C. ulceranstox. (токсигенный), C. xerosis, C. minutissimum, C. jeikeium, C. diphtheriae, C. diphtheriae tox. (токсигенный)из музея кафедры, олигонуклеотиды DT-f ata-ggg-gcc-cca-cct-tca-g, DT-r tct-tcc-gtt-ccg-act-tgc-tc, toxR-f aga-cga-act-cgg-tgt-ttc-cc, toxR-r gcc-aat-tcg-aat-gtc-tgc-gt. Для амплификации в работе использовали «Набор реагентов для проведения ПЦР-РВ с интеркалирующим красителем EvaGreen, Taq–ДНК–полимеразой и ингибирующими активность фермента антителами» («Синтол», Москва), а также детектирующий амплификатор ДТ-96 («ДНК-Технология», Москва).

Результаты исследований

При помощи ресурса NCBI Blast нами были проанализированы и выровнены нуклеотидные последовательности генов дифтерийного токсина и его регулятора. Затем были разработаны олигонуклеотиды для детекции дифтерийного токсина DT и регулятора toxR. После подбора, выравнивания и оптимизации олигонуклеотидов была оптимизирована программа амплификации для проведения ПЦР в режиме «реального времени»:

95°С – 5 мин. – 1 цикл

95°С – 10 сек.

60°С – 20 сек. – 35 циклов

72°С – 1 мин. – 1 цикл.

После ряда проведенных экспериментов было определено оптимальное количество праймеров в реакциях: 8 пмоль на реакцию объемом 25 мкл – для детекции участка дифтерийного токсина, 10 пмоль – для детекции участка ДНК гена-регулятора экспрессии дифтерийного токсина. Результаты амплификации отражены в таблице 1.

Таблица 1 – Сp Fam при RT-PCR проб с содержанием ДНК

штаммов коринебактерий

Идентификатор	Сp Fam	Сp Fam
	DT	toxR
C. ulcerans C125	-	-
C. ulcerans tox. 1568	24,3	18,5
C. xerosis 2455	-	-
C. minutissimum Cm36	-	-
C. jeikeium 25/14	-	-
C. diphtheriae 74	-	-
C. diphtheriae tox. 1981	25,2	20,6
C. ulcerans 2415tox.	28,6	27,3
C. ulcerans 2214 tox.	22,4	19,2
C. diphtheriae 168 tox.	26,1 -	24,5
Отрицательный контроль	-	-
Отрицательный контроль	-	-

Выводы

В результате проведенных экспериментов нами были выявлены участки гена дифтерийного токсина у вирулентных штаммов C. ulcerans и C. diphtheriae с использованием разработанной праймерной системы, фланкирующей консервативный участок гена данного токсина. Также в результате проведенных исследований была разработана система праймеров для детекции участка гена-регулятора экспрессии дифтерийного токсина и оптимизирована программа амплификации для прибора ДТ-96 с детекцией в режиме «реального времени». Совместное использование данных систем при детекции штаммов C. ulcerans и C. diphtheriae позволяет определить как специфический участок дифтерийного токсина, так и его регулятор. Также в результате экспериментов установлена аналогия участков отжига разработанных систем праймеров на культурах как C. ulcerans, так и C. diphtheriae, что может свидетельствовать об их гомологичности в структуре оперона дифтерийного токсина.

Библиографический список:

Comparison of phenotypic and genotypic methods for detection of diphtheria toxin among isolates of pathogenic corynebacteria / Efstratiou A., Engler K.H., Dawes C.S., Sesardic D. / J Clin Microbiol. – 1998. – №36(11). – P.3173.

Taylor, D. J. / Diphtheria toxin production by Corynebacterium ulcerans from cats / D. J. Taylor, A. Efstratiou, and W. J. Reilly // – Vet. Rec. – 2002. – V.150. – P.355.

Infection of the skin caused byCorynebacterium ulcerans and mimicking classical cutaneous diphtheria / J. Wagner et al. // – Clin. Infect. – 2001. – №33. – P.1598-1600.

Код для цитирования: Скопировать