X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2018

Комбинирование лекарственных препаратов является базой для современной клинической практики. Совместный прием препаратов может вызвать побочный эффект и даже гибель. Поэтому определение межлекарственныхвзаимодействий а также влияние различных ферментов на метаболизм лекарственных препаратов является основой для безопасной терапии.

CYP3A4 является одним из большой группы ферментов цитохрома P450. Белки цитохрома P450 — это монооксигеназы, которые катализируют многие реакции, участвующие в метаболизме лекарств, синтез холестерина, стероидов и других жиров (Hashimoto H, Toide K, Kitamura R, 1993). Большинство препаратов дезактивируются с помощью CYP3A4 или напрямую, или посредством облегченного выведения из организма. Кроме того, некоторые вещества активируются при помощи CYP3A4, а некоторые протоксины — преобразуются в свои токсичные формы. Ингибирование цитохрома влияет на фармакокинетику лекарственных препаратов. Например, ингибируя этот фермент противогрибковыми препаратами - кетоконазола или итраконазола приводит к удлинению периодов полувыведения лекарственных препаратов, метаболизирующихся с участием цитохрома Р450. Влияние ингибиторов различно и не до конца изучено ровно также, как и наличие потенциальных ингибиторов, поэтому имеет смысл изучение этого вопроса.

Выбор ивабрадина в качестве субстрата для изофермента 3А4 цитохрома Р450 основан на том, что ивабрадин считается селективным ингибитором, он не оказывает прямого действия на фермент, что повышает интерес к нему.

Ивабрадин - препарат, который замедляет ритм сердца. Он ингибирует If-каналы синусовогоузла.снижает ЧСС, что в свою очередь уменьшает риск развития тяжелой брадикардии (ЧСС менее 40 уд./мин) (Егорова Н.А., 2008). Метаболизм ивабрадина в большей степени происходит в печени за счет окисления с помощью цитохрома Р450 ЗА4 (изофермента CYP3A4) (Головенко Н.Я., 2004). Основным активным метаболитом является N-десметилированное производное, имеющее концентрацию около 40 % по сравнению с концентрацией исходного вещества. В метаболизме данного активного метаболита также участвует изофермент CYP3A4. Ивабрадин обладает низкой степенью сродства к изоферменту CYP3A4, не демонстрируя клинически значимой индукции или ингибирования изофермента CYP3A4, вследствие чего изменение метаболизма или концентрации субстратов данного фермента в плазме крови под действием ивабрадина является маловероятным. В то время, как сильные ингибиторы и индукторы цитохрома Р450 значительно влияют на концентрацию ивабрадина в плазме крови. Таким добавочным ингибитором для ивабрадина является мифепристон.

Цель исследования: изучение время-зависимого ингибирования изофермента 3A4 цитохрома Р450 (CYP450) препаратом ивабрадин в микросомах печени крыс, используя тестостерон в качестве модельного субстрата и мифепристона в качестве специфического ингибитора.

Задачи исследования:

Разработать и валидировать методику хромато-масс-спектрометрического количественного определения тестостерона и его метаболита 6β-гидрокситестостерона.

Провести оптимизацию параметров инкубации тестового субстрата (ивабрадина) и модельного время-зависимого ингибитора (мифепристона) с микросомами печени крыс.

Определить значения IC₅₀ после предварительной инкубации ивабрадина с микросомами, содержащими фермент CYP3A4, в отсутствии и в присутствии кофермента NADPH, и вычислить отношение этих величин («сдвиг» IC₅₀) и сделать вывод относительно возможности отнесения ивабрадина к время-зависимым ингибиторам.

Дизайн исследования:

Тестируемые вещества (ивабрадина) в шести концентрациях будут преинкубированы с микросомами крысы, полученными по оптимизированному ранее протоколу в присутствии/без NADPH в при 37 °С. После 30 минут преинкубации смесь разбавляется в 10 раз раствором, содержащим специфический субстрат (тестостерон) для измерения остаточной активности ферментов и инкубируется. Реакцию останавливают ацетонитрилом через 15 мин после добавления субстратов. Образующийся метаболит (6β-гидрокситестостерон) детектируют с помощью ВЭЖХ-МС/МС анализа. В качестве контроля будет применён специфический ингибитор (мифепристон).

Предполагаемые пути решения задач:

Методика ВЭЖХ-МС/МС определения тестостерона и его метаболита будет разработана и валидирована с использованием хроматографической системы Agilent 1260 и масс-спектрометра SciexQTRAP5500. В рамках оптимизации параметров инкубации будет определён диапазон концентраций тестового субстрата ивабрадина, концентрация ингибитора и время инкубации, обеспечивающее получение наиболее воспроизводимых информативных данных. Обработка данных и статистический анализ будет произведен с использованием программы GraphPadPrism 5.0. IC₅₀ будет рассчитан как показатель концентрации тестового лекарственного вещества, необходимого для 50 % ингибирования тестовой реакции invitro. Тестовый субстрат, демонстрирующий «сдвиг» IC₅₀ ≥ 1.5 в ходе invitroэксперимента, классифицируется как время-зависимый.