IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2017

ВВЕДЕНИЕ

Человечество вошло в третье тысячелетие с большим запасом знаний в области наук о жизни и большим потенциалом их практического использования. Человек может изменять наследственность окружающего его живого мира - бактерий, растений, животных и человека. Появились беспрецедентные возможности технологического прогресса (биотехнология и биоинженерия), открывшего также новые пути в медицине (генная терапия) и сельском хозяйстве (трансгенные, или генетически модифицированные, растения и животные). Все это возникло на базе революционных прорывов в науке (молекулярная биология), которые затем и породили биотехнологическую революцию. Появление генетически модифицированных организмов (ГМО) на продовольственном рынке несколько лет назад, и спрос на более точные и надежные методы для обнаружения иностранных (трансгенных или патогенных) ДНК в съедобных растениях, были движущей силой для внедрения полимеразной цепной реакции в реальном времени, как метода исследований в растениеводстве.

Полимеразная цепная реакция – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты в биологическом материале. Такой процесс увеличения числа копий ДНК называется амплификацией. Копирование ДНК при полимеразной цепной реакции осуществляется специальным ферментом – полимеразой.

Открытию полимеразной цепной реакции предшествовало развитие молекулярно-биологических технологий.

В 1869г. И. Мишером была открыта ДНК. Биологическая функция нового вещества была не ясна.

В 1944г ученые О. Эвери, К. Мак-Леода и М.Мак-Карти провели ряд экспериментов по трансформации бактерий, доказавшие, что за трансформацию (приобретение болезнетворных свойств безвредной культурой в результате добавления в неё мёртвых болезнетворных бактерий) отвечают выделенные из пневмококков ДНК.

В 1955г. А. Корнберг открыл фермент, который назвал ДНК-полимеразой.

Этот фермент способен удлинять короткие олигонуклеотидные затравки (праймеры), присоединяя к 3'-концу цепи ДНК дополнительный нуклеотид, но для этого необходимо, чтобы праймер был связан с комплементарной цепью ДНК (матрицей). Раствор, в котором происходит эта реакция, должен содержать нуклеозидтрифосфаты (дНТФ), используемые в качестве строительных блоков.

В 1971г. Клеппе и соавт. представили данные, касающиеся состава ингредиентов реакционной смеси, и принципы использования коротких искусственно синтезированных молекул ДНК-праймеров для получения новых копий ДНК.

Однако возможность использования полимеразной цепной реакции в плане наработки большого количества копий нуклеиновых кислот еще не рассматривалась. Это было связано с техническими трудностями, обусловленными необходимостью трудоемкого синтеза праймеров, и нестабильностью фермента. В начале использования метода полимеразной цепной реакции после каждого цикла нагревания – охлаждения ДНК-полимеразу приходилось добавлять в реакционную смесь, так как она быстро инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура была очень неэффективной, требовала много времени и фермента.

В 1975г. Т. Брок и Х.Фриз открыли – грамотрицательную палочковидную экстремально термофильную бактерию, а в 1976 г. из нее была впервые

выделена -полимераза.

Преимуществом данного фермента была способность стабильно работать при повышенных температурах (оптимум 72-80 °C).

В 1983-1984 гг. К. Мюллис провел ряд экспериментов по разработке полимеразной цепной реакции и первым начал использовать полимеразу вместо неустойчивой к высоким температурам ДНК-полимеразы. Это позволило ускорить работы по разработке полимеразной цепной реакции. Кроме того, К. Мюллис вместе с Ф. Фалуном разработал алгоритм циклических изменений температуры в ходе полимеразной цепной реакции.

Таким образом, сформировался принцип использования полимеразной цепной реакции, как метода амплификации заданных фрагментов ДНК с полностью

или частично известной последовательностью.

Результатом открытия полимеразной цепной реакции стало почти немедленное практическое применение метода. В 1985 году Saiki с соавт. опубликовали статью, в которой была описана амплификация геномной последовательности β-глобина. С этого момента количество публикаций, о применении полимеразной цепной реакции в своих работах, стало увеличиваться в геометрической прогрессии.

В настоящее время предложены различные модификации полимеразной цепной реакции, показана возможность создания тест-систем для обнаружения микроорганизмов, выявления точечных мутаций, описаны десятки

различных применений метода.

Таким образом, открытие метода полимеразной цепной реакции стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Это позволило поднять медицинскую диагностику на

качественно новый уровень.

В современной фитопатологии полимеразной цепной реакции применяют не только для диагностики патогенов растений. Эта техника широко используется для мониторинга болезней растений, а также для детекции возбудителей болезней в органах вегетирующих растений, семенах, фруктах и другой хранящейся продукции растениеводства. Она была применена для обнаружения вирусов многих экономически важных сельскохозяйственных культур и других культивируемых растений. Протоколы полимеразной цепной реакции были разработаны для многих важных фитопатогенных бактерий, и ряд праймеров, подходящих для их идентификации, приведен в соответствующих руководствах по идентификации фитопатогенных бактерий. Метод полимеразной цепной реакции применяется также для обнаружения фитопатогенных нематод, в частности с целью контроля золотистой и бледной картофельных нематод, являющихся карантинными объектами.

Полимеразная цепная реакция в растениеводстве - вирусные инфекции культурных растений вызывают ощутимые потери урожая, заметно ухудшают качество сельскохозяйственной продукции и все чаще рассматриваются как серьезная угроза продовольственной безопасности. Эта проблема касается всех продовольственных, кормовых и технических культур, возделываемых в любом регионе мира, и особенно актуальна для вегетативно размножаемых растений, поскольку прогрессирующее накопление вирусов в ряду поколений приводит к полному заражению и вырождению сорта. В настоящее время производство безвирусного семенного и посадочного материала основано, главным образом, на выбраковке зараженных и отборе здоровых растений для их последующего размножения.

При тотальном заражении сорта, когда отбор неэффективен, растения оздоравливают от вирусов с помощью термотерапии и культуры меристем. Однако, существующие методы оздоровления не гарантируют полного избавления от патогена.

Важнейшую роль в предупреждении распространения вирусных инфекций играет карантинный контроль продукции растениеводства, особенно импортируемого семенного и посадочного материала. Поэтому все этапы получения безвирусных растений должны сопровождаться анализами на присутствие вирусов.

Очевидно, что для осуществления такого отбора необходимо располагать чувствительными методами массовой диагностики вирусов.

На данный момент разработаны диагностические наборы для полимеразной цепной реакции анализа ряда наиболее распространенных патогенных микроорганизмов защищенного грунта, особенно важных при выращивании овощных культур, в первую очередь огурцов и томатов.

Применение таких диагностических наборов позволяет получить в течение нескольких часов быстрые и достоверные результаты, позволяющие сделать своевременную выбраковку семенного материала, а также при необходимости подобрать оптимальные состав и дозы реагентов для химической обработки растений, уменьшая тем самым потери урожая.

Сам метод полимеразной цепной реакции основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях . При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от ампли- фикации ДНК в живых организмах, с помощью полимеразной цепной реакции амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований. С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20—40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований.

1. Механизм полимеразной цепной реакции

Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо наличие в реакционной смеси ряда основных компонентов.

Праймеры– искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 нуклеотидов, идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы и должны отвечать ряду критериев: быть специфичными, не должны образовывать димеры и петли, область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсеций в пределах видовой или иной специфичности, взятой в качестве критерия при выборе праймеров. При попадании на такую зону, отжиг праймеров не происходит, и, как следствие, возникает ложноотрипадании на такую зону, отжиг праймеров не происходит, и, как следствие, возникает ложноотрицательный результат.

Taq-полимераза– термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание З'-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности.

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) – строительный материал, используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

Буфер– смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающей оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН.

Анализируемый образец– подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК, например, ДНК микроорганизмов, служащую мишенью для последующего многократного копирования.

Если в анализируемом образце присутствует искомая ДНК, то в процессе реакции амплификации с ней происходит ряд событий, которые обеспечиваются определенными температурными циклами. Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов: денатурация, отжиг, элонгация (синтез).

2. Стадии постановки полимеразной цепной реакции

ПЦР-анализ состоит из трех стадий:

Для подготовки пробы к постановке полимеразной цепной реакции используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в извлечении ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки реакции амплификации.

На данный момент разработаны варианты постановки полимеразной цепной реакции, направленные на решение следующих задач: увеличение эффективности реакции и снижение риска образования неспецифических продуктов; реализацию возможности проведения как качественного, так и количественного анализа искомых участков молекулы ДНК.

На сегодняшний день существует несколько основных способов детекции результатов полимеразной цепной реакции: электрофоретический, гибридизационно-ферментный, гибридизационо-флуоресцентный.

3. Контроль полимеразной цепной реакции

Лаборатории, использующие в своей работе метод полимеразной цепной реакции, должны осуществлять следующие виды контроля: производственный, внутрилабораторный, внешний контроль работы лаборатории.

ЛИТЕРАТУРА

1.Зорина В.В.(сост.) «Основы полимеразной цепной реакции» Методическое пособие ДНК-технология, 2012г.-80с.

2.Козыбаев А, Набиева Ж.С.,Якинева М.А. «Полимеразная цепная реакция реального времени» Инновация в науке: №10(35) 2014г.

3.Оберемок В.В., Методические рекомендации к применению ПЦР-метода.

Код для цитирования: Скопировать