IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2017

В любой живой клетке существует физиологический нормальный уровень свободных радикалов, который контролирует ряд биосинтетических процессов и проницаемость мембраны. Многие активные кислородные метаболиты постоянно продуцируются в клетках в качестве продуктов нормального метаболизма – регуляция функций клетки, подавление роста конкурирующих организмов. Такая внутриклеточная концентрация активных форм кислорода и реактивных форм азота достаточна низкая и клетка инактивирует их с помощью специализированных рецепторных белков входящих в состав soxRS и oxyR регулонов, обеспечивающих мультивалентную экспрессию защитных ферментных систем [1].

Активация белка SoxR происходит при воздействии супероксид аниона, при этом он окисляется и активирует транскрипцию белка SoxS, являющимся вторичным транскрипционным фактором, запускающим экспрессию генов soxRS-регулона (например, sodA (марганцевая суперосиддисмутаза), nfo (эндонуклеаза IV), marAB (оперон множественной антибиотикоустойчивости), tolC (белок внешней мембраны), micF (антисмысловая РНК, репрессор трансляции OmpF), fumC (кодирует фумаразу С), acrAB (кодирует помпу эффлюкса), fur (железосвязывающий регуляторный белок)) [2].

Активация белка OxyR происходит при воздействии пероксида водорода, вследствие чего сульфидная группировка цистеина гидролизуется и затем конденсируется с образованием дисульфидного мостика, что ведет к изменению конформации белка, который активирует транскрипцию генов oxyR-регулона (например, katG (каталаза-гидропероксидаза I), ahpFC (НАДН-зависимая алкилгидропероксидредуктаза), grxA (глутаредоксин А), gor (глутатионредуктазу), oxyS (кодирует регуляторную РНК)) [3].

Однако в определенных условиях, в результате внутренних или внешних нарушений, возрастает скорость продукции активных форм кислорода или снижаются защитные способности клеток, вследствие чего формируется состояние известное, как окислительный стресс. Для его детекции применяют хемилюминесцентные индикаторы, при взаимодействии с некоторыми активными формами кислорода они испускают кванты света. Наиболее популярными являются люминол и люцигенин. Инициатором хемилюминесценции люцигенина выступает анион супероксида (O₂^•-), интермедиатом данной реакции является N-метилакридон.

Инициатором хемилюминесцентной реакции соединения люминола служит перекись водорода (H₂O₂) и гидроксил-радикал (HO^•). При взаимодействии люминола с гидроксид-ионами образуется дианион, который взаимодействует с кислородом. Продуктом этой реакции является крайне нестабильный органический дирадикал, который моментально распадается с образованием азота и молекулы 3-аминофталевой кислоты в возбуждённом электронном состоянии. При возвращении молекулы из возбуждённого в основное электронное состояние выделяется фотон. В связи с этим аминофталат-ион является интермедиатом [4].

Также для обнаружения используются колориметрические методы с применением хромогенных субстратов, при взаимодействии с некоторыми видами активных форм кислорода их оптические свойства изменяются. Для этих методов определения окислительного стресса характерны довольно низкая чувствительность и высокая вероятность появления артефактов в измерении, которые необходимо учитывать при интерпретации результатов. Цитохром-С (феррицитохром-С) используется для регистрации в системе O₂^•. Реакция возможна благодаря свойству O₂^• восстанавливать некоторые соединения. В случае феррицитохрома-С[Fe(III)], O₂^• восстанавливает его до ферроцитохрома-С[Fe(II)], при этом поглощение при 550 нм увеличивается [5].

Кроме цитохрома-С используют соли тетразолия, которые тоже восстанавливаются O₂^•, в результате чего эти индикаторы претерпевают структурные изменения и приобретают окрашивание. При взаимодействии индикатора с O₂^• образуется водонерастворимое соединение формазан с максимумом поглощения при 560 нм. Формазан образуется не прямым способом, а через промежуточный нестабильный тетразоил радикал. При взаимодействии тетразоил радикала с О₂ может образовываться O₂^•. Другой важный недостаток заключается в том, что некоторые клеточные восстановители, как глутатион или НАДФН, могут его восстанавливать [5, 6]. Созданы и более улучшенные индикаторы на основе солей тетразолия, которые, тем не менее, не решают всех имеющихся проблем. Например, проблема восстановления индикатора другими компонентами независимо от O₂^• по-прежнему остается актуальной [7].

Помимо выше перечисленных методов для изучения активных форм кислорода широко применяются флуоресцентные красители. Принцип работы таких индикаторов основан на изменении их интенсивности флуоресценции при взаимодействии с активными метаболитами кислорода. Ярким примером является молекула 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (DPPH), являющаяся стабильным свободным радикалом. Присутствие активных форм кислорода вызывает глубокий фиолетовый цвет, характеризующийся полосой поглощения в растворе этанола около 517 нм. В присутствии донора водорода данная молекула восстанавливается с утратой специфической окраски [8].

В связи с недостатками выше перечисленных методов наиболее адекватным способом оценки является применение клеточных систем. В качестве таковых чаще всего применяются бактериальные биосенсоры, для этого проводят интеграцию различных генов детекции под контролем определенного промотора. В качестве репортерных генов используют ген lacZ, кодирующий β-галактозидазу, ген gfp, кодирующий зеленый флуоресцирующий белок, либо гены luxCDABE, представляющие собой кассету генов бактериальной биолюминесценции. При этом интеграция подобных детектируемых генов под контролем промоторов различного типа позволяет получить два принципиально отличающихся типа биосенсоров. Первая группа основана на оценке токсического действия препарата на бактериальную клетку, что оценивается по снижению интенсивности активности репортерного гена, а вторая группа содержит специфический промотор, инициируемый в присутствии определенного вещества в среде или внешнего фактора.

Бактериальные тест-системы получают все большее распространение при исследовании биологической активности различных веществ. Биотесты на основе светящихся бактерий дают интегральную оценку токсичности и часто превосходят другие известные биотесты в скорости, точности, чувствительности и простоте использования. Исследование окислительного стресса с использованием люминесцирующих бактериальных биосенсоров позволяет оценить различные параметры окислительного стресса, что делает этот метод очень перспективным.

Список литературы

1. Николайчук, А. Е. Регуляция метаболизма: курс лекций / Е. А. Николайчук. – Минск, 2002. – 46 с.

2. Imlay J.A. Cellular defenses against superoxide and hydrogen peroxide. Annu. Rev. Biochem, 2008, V. 77, pp. 755-776.

3. Zheng M., Wang X., Zheng M., Templeton L.J., Smulski D.R, LaRossa R.A., Storz G. DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide. J. Bacteriol., 2001, V. 183, no. 15, pp. 4562- 4570.

4. Васильев, Р. Ф. Химическое свечение / Р. Ф. Васильев // Химия и химики. – 2010. − № 1. – С. 34-37.

5. M. Freitas, J.L. Lima, E. Fernandes, Optical probes for detection and quantification of neutrophils' oxidative burst. A review, Anal. Chim. Acta.,2009, V.649, pp. 8-23.

6. G. Bartosz, Use of spectroscopic probes for detection of reactive oxygen species, Clin.Chim. Acta.,2006, V.368, pp. 53-76.

7. R.E. Schopf, J. Mattar, W. Meyenburg, O. Scheiner, K.P. Hammann, E.M. Lemmel,Measurement of the respiratory burst in human monocytes and polymorphonuclear leukocytesby nitro blue tetrazolium reduction and chemiluminescence, J. Immunol Methods,1984, P.-67.

8. Md. Nur Alam, Nusrat Jahan Bristi, Md. Rafiquzzaman Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharmaceutical Journal, 2003, V. 21, no.15, pp. 143-152.

Код для цитирования: Скопировать