IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2017

Важной составляющей экспериментальной работы является оценка абсолютного числа клеток в различных биологических жидкостях (кровь, перитонеальный смыв, спинномозговая жидкость, сперма и т.д.), а также клеточных суспензий органов (селезенка, лимфатический узел, тимус и т.д.).

Классической методикой абсолютного счета клеток является использование различных гемоцитометров или стеклянных счетных камер. В России используется счетная камера с нанесенной сеткой Горяева [1]. В остальном мире используется усовершенствованный вариант камеры Нейбауэра (Improved Neubauer) [4]. Вариант сетки камеры Горяева дает меньшую погрешность в отличие от камеры Нейбауэра, т.к. имеет большее количество квадратов расположенных на большем расстоянии друг от друга, в камере Нейбауэра квадраты соединены вместе. Ошибка метода в камере Горяева составляет от 10 до 20% [ 5], тогда как в камере Нейбауэра может составлять от 7 до 24 % [6].

В лабораториях используются компактные автоматизированные счетчики на основе пластиковых кассет определенного образца. Это такие приборы, как Thermo Countess II, Nexcellom T4 и Biorad TC-20. Каждая фирма выпускает собственный вид кассет, которые подходят только к определенному виду прибора. Как правило, кассеты одноразовые и дорогостоящие, а также существует риск прекращения поддержки прибора, т.к. приборы используют фирменные закрытые технологии. Автоматизированный счетчик на основе микроскопии считает с большой скоростью, что ускоряет эксперимент по сравнению с гемоцитометрами, а также исключается субъективное влияние экспериментатора [7] .

На рынке присутствует и ряд аппаратов с открытой технологией, где не нужны специальные пластиковые счетные камеры: Beckman Vi-Cell, Roche cedex counter. Их плюсы заключаются в том, что материал биологической пробы, может быть автоматизировано забран сразу из пробирки. На этих приборах также возможно определение жизнеспособности клеток с помощью трипанового синего автоматизированным методом.

Другая категория приборов основана на принципе Култера (coulter-principle), то есть регистрация электрических импульсов, возникающих при прохождений частиц через апертуру прибора. В отличие от микроскопических методов, приборы с принципом Култера основывают свои расчёты на колоссально большом количестве обрабатываемых клеток, число которых может достигать от 10 до 50 тысяч. Наиболее распространенные приборы в которых используется метод Култера: Beckman coulter multisizer, Beckman coulter Z1 и Z2, а также в большинстве гематологических анализаторов. Существуют портативные приборы на основе одноразовых кассет похожих на полоски для глюкометра, такие как Orflo Moxi Z, а также Millipore Scepter™, в формате пипетки, что обеспечивает быстрый и удобный способ для подсчета клеток или частиц [6]. Погрешность счёта на счетчике с принципом Култера составляет около 2-3%, в то время как у методов, основанных на микроскопии, достигают до 15% и выше. Также абсолютным счетом клеток обладает и ряд проточных цитометров, которые используют цифровую обработку данных, такие как Guava Easycyte [2, 3].

В ходе проделанной мною работы, я изучил характеристики каждого из счетчиков, их возможности и особенности. В дальнейшем планируется сравнение результатов полученных с различных счетчиков опытным путем, выявление наиболее универсального аппарата для исследования биологического материала с использованием статистических методов с наименьшей погрешностью.

Список литературы

1. Нормальная физиология: методические рекомендации к практическим занятиям / М.Д. Берг, В.Д. Тютюнщикова, Е.В. Кадырова, М.Л. Кононова, В.В. Савкин, С.Г. Езов, Т.Г. Сагитова; под ред. М.Д.Берг. - Пермь: Книжный формат, 2010. - 161 с.

2. Шилов С.Ю., Жукова А.Е., Петухова А.А., Барков С.Ю., Шилов Ю.И. Оценка фагоцитарной активности перитонеальных клеток и лейкоцитов крови крыс с использованием маркера ацидификации фагосом pHrodo^TM // Российский иммунологический журнал. - 2015. - Т. 9(18), № 2 (1). - С. 352-354.

3. Шилов Ю.И., Шилов С.Ю., Жукова А.Е., Барков С.Ю., Петухова А.А. Изменение уровня ацидификации фагосом у крыс в зависимости от фазы эстрального цикла // Российский иммунологический журнал. - 2016. - Т. 10 (19), № 2 (1). - С. 183-184.

4. Эндрю Б. Л. Экспериментальная физиология. — М.: Мир, 1974.— 352 с.

5. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования / Под ред. Е. А. Кост, М., 1975. - С. 22.

6. Dittami G.M., Sethi M., Rabbitt R.D., Ayliffe H.E. Determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the moxi z mini automated cell counter //JoVE (Journal of Visualized Experiments). – 2012. – №. 64. – P. e3842-e3842.

7. Jensen R.B., Ozes A,. Kim T., Estep A., Kowalczykowski S.C. BRCA2 is epistatic to the RAD51 paralogs in response to DNA damage //DNA repair. – 2013. – Vol. 12, issue 4. – P. 306-311.

Код для цитирования: Скопировать