IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2017

В настоящее время в арсенале челюстно-лицевых хирургов имеется множество различных материалов, которые используются для устранения различных травм и деформаций лицевого и мозгового отделов черепа, такие как: металлические, керамические синтетические, а также различные биологически инертные материалы [1-8]. Однако анализ отдалённых результатов применения этих материалов в челюстно-лицевой хирургии выявил их недостатки: частичное или полное рассасывание с утратой исходной формы и размеров, нагноение операционной раны с отторжением трансплантата, смещение и инкапсуляцию имплантатов. При подборе имплантационных материалов наибольшее значение имеет их биологическая совместимость, т.е. влияние биологической среды на материал имплантата, а также воздействие материала имплантата на окружающие живые ткани [9]. Особое место занимают пористые изделия, позволившие решить многие проблемы при лечении утраченной костной ткани. Пористый никелид титана получают, используя методы порошковой металлургии: высокотемпературное спекание порошка никелида титана или самораспространяюшийся высокотемпературный синтез (СВС) из порошков титана и никеля.

Для пористых материалов медицинского назначения первостепенное значение имеют биохимическая совместимость с тканями организма. Биосовместимость определяется, в первую очередь, фазовым составом материала. Никелид титана, полученный методом СВС, характеризуется фазовой неоднородностью – наряду с основной фазой TiNi в значительном количестве присутствуют вторичные фазы Ti₂Ni и TiNi₃ [10]. Вопрос о влиянии вторичных фаз на биохимические свойства никелида титана остается открытым. Так, в работе [11] установлено, что наличие фазы Ti₂Ni повышает электрохимическую коррозию имплантатов из литого никелида титана и, соответственно, может отрицательно влиять на их биосовместимость. Однако экспериментальные и клинические исследования, выполненные В.Э. Гюнтером с сотрудниками, не выявили негативного влияния вторичных фаз на биосовместимость СВС-никелида титана. Вместе с тем следует отметить, что фазовый состав оказывает сильное влияние на характеристическую температуру мартенситных превращений и параметры памяти формы. Например, изменение содержания компонентов на сотые доли процента ведут к сдвигу температуры фазовых превращений в материалах на основе никелида титана на десятки градусов [10]. Поэтому в системе Ti-Ni желательно иметь только основную фазу TiNi и стабильные физико-механические свойства и параметры памяти формы.

Содержание вторичных фаз в СВС-никелиде титана можно уменьшить за счет увеличения температуры синтеза в зоне фазообразования. В работе [12] с этой целью использовался предварительный нагрев исходной шихты внешним нагревателем. Установлено, что при начальной температуре шихты 500 °С обогащенных никелем вторичных фаз (фаза TiNi₃) практически не наблюдается. Увеличение начальной температуры шихты до 600 °С и выше приводит к повышению температуры в зоне фазообразования настолько, что из-за чрезмерного содержания жидкой фазы конечный продукт в поле сил тяжести теряет свою структурную устойчивость и происходит усадка и уменьшение пористости. Таким образом, предварительный нагрев исходной шихты внешним нагревателем не обеспечивает получение однофазного СВС-никелида титана из смеси порошков титана и никеля. При этом ограничением «сверху» на начальную температуру шихты является образование большого количества жидкой фазы в зоне фазообразования. В этой связи для увеличения температуры синтеза предлагается использовать не внешний, а внутренний источник тепла в виде добавки в исходную шихту высокоэкзотермических реагентов. При этом продукты реакции добавляемых компонентов должны иметь биосовместимость с тканями организма и более высокую температуру плавления, чем соединения титана с никелем. Тогда силами поверхностного натяжения жидкой фазы частицы тугоплавкой фазы будут стягиваться в твердожидкий каркас, сохраняющий свою форму в поле сил тяжести. Указанным требованиям в полной мере отвечает нестехиометрический карбид титана TiC_0,5. Температура горения при синтезе карбида TiC_0,5 составляет 2500 °С, а температура горения при синтезе никелида титана с нагревом исходной шихты Ti-Ni до температуры 500 °С не превышает 1650 °С. Температура плавления карбида TiC_0,5, которая равна Т_пл ≈ 2500 °С, также намного выше, чем температура плавления наиболее тугоплавкой фазы TiNi₃, у которой Т_пл = 1380 °С.

В настоящее время большинство производителей имплантатов тестируют свои материалы в экспериментах на животных, однако переносить результаты таких исследований в полном объеме на человека некорректно [13]. Отдельно стоит заметить, что использование животных в качестве испытуемых при наличии альтернативных методик, неэтично. Первые публикации о тестировании имплантатов на клеточных культурах, найденные в электронной библиотеке датированы 1973 годом [14]. Эта технология тестирования и в настоящий момент имеет распространение как первый этап биологического тестирования биосовместимости и токсичности имплантатов. Одним из вариантов клеточной культуры для тестирования имплантатов является мультипотентные мезенхимально стромальные клетки (ММСК). ММСК можно обнаружить в составе практически любой соединительной ткани. Активное участие этих клеток в процессах регенерации доказано работами различных авторов[15]. Использование мультпотентных мезенхимально-стромальных клеток позволит на клеточном уровне показать влияние имплантата на клетки соединительной ткани. Появляется возможность изучать такие биологические явления имплантатов, как индукция дифференцировки, стимуляция или угнетение пролиферации и способности к миграции, а так же мутагенные и токсические эффекты. При условии отсутствия токсических эффектов имплантата можно оценить его адгезивные качества. Так- же возможно исследование скорости и глубины прорастания клеток в имплантат, что позволяет предположить степень интеграции материала. Результаты исследования материалов на культуре ММСК, представляют ценную информацию о биологических свойствах имплантатов в организме еще до исследования на животных, и позволяют дорабатывать и изменять материал до получения необходимых свойств.

Цель настоящей работы – получить пористый СВС-материал на основе нестехиометрического карбида титана с никелид-титановой связкой и исследовать биосовместимость на культурах мезенхимальных мультипотентных стволовых клеток костного мозга человека.

Материалы и методы

При составлении экзотермических шихт использовались порошки следующих марок: титан ПТС; углерод технический (сажа) П804Т и никель ПНЭ-1. Шихтовая смесь готовилась из расчета образования двухфазного продукта состава TiC_0,5 – 25% (мас.) Ni. Дозировка компонентов шихты осуществлялась с точностью 0,1 г. Приготовление экзотермической шихты массой 0,2 кг заданного состава производилось в шаровой мельнице объемом 1 л при соотношении масс шаров и шихты 3:1. Время смешивания составляло 4 часа. Из шихтовых смесей односторонним прессованием в цилиндрической матрице получали заготовки диаметром 23 мм, массой 20 г и пористостью 40 ÷ 45%. С целью повышения порообразования в шихту добавляли 2% (мас.) пищевого крахмала. Синтез проводили при комнатной температуре в газопроницаемой оболочке из речного песка. Микроструктурный анализ осуществляли на растровом электронном микроскопе Jeol JSM-6390A. Состав продуктов синтеза определяли методом рентгенофазового анализ. Съемка рентгеновских спектров проводили на дифрактометре ARL X′TRA.

СВС-материал поступил на исследование нестерильным, был отмыт путем пятикратного погружения в 50 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (Sigma)с активным перемешиванием на шейкере в течение 60 минут, высушен, закрыт в пакеты для автоклавирования, простерилизован в автоклаве при температуре 121 С, 2,1 атм., в течении 20 минут.

Полученные клеточные культуры были характеризованы на принадлежность к. В работе были использованы мультипотентные мезинхимальные стромальные клетки 2 пассажа со следующим фенотипом: позитивны на CD73, CD90, CD105, CD44 и негативны CD14, CD34, HLA-DR. Клетки культивировали в стандартных условиях в инкубаторе SANYO MCO-20AV в режиме 37 °С, 5% СО в культуральных флаконах (NUNC), площадью 175 см².

Тестирование проводилось в культуральных 24 луночных планшетах (NUNC) на среде AMEM (Sigma), 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone), 2mM L- аланин-глутамине (Invitrogen).

Опыт осуществляли методами прямого контакта и эксплантатов – мезинхимальных клеток. Исследуемый материал помещали в лунки 24 луночного планшета (NUNC) с культуральной средой, куда, через 10 минут помещали клетки (100.000 клеток на лунку) из культурального флакона. Подсчет клеток и анализ их жизнеспособности проводился на автоматизированном анализаторе Vi-Cell XR. Через 2 часа планшет был осмотрен на микроскопе, с целью подтверждения адгезии клеток к поверхности пластика. Морфология оценивалась при помощи инвертированного микроскопа проходящего света с системой видеонаблюдения «Сarl ZEISS Observer. A1». Морфометрия проводилась с помощью программного комплекса AxioVision 6.3. Наличие клеток на материале и характер их роста изучались на электронном микроскопе JEOL JSM-63909A. Клетки с материалом фиксировали в несколько этапов. Отмывали фрагменты в PBS (фосфатно-сульфатном буфере), затем в течении 10 минут фиксировали в 2,5% растворе глютарового альдегида и проводили обезвоживание в растворе пропанола нарастающей концентрации 40%, 60%, 80%, 99,5%, с экспозицией каждого – 5 минут. Фрагменты материала помещали в вакуумную камеру, с целью напыления золота на его поверхность.

Контролем эксперимента служили: 1) секции с питательной средой и образцами материала в которые не высеивали мезинхимальные клетки, 2) секции с культурами мезинхимальных клеток, которые пассировали и наблюдали одновременно с экспериментальными, не помещая материал. Всего в эксперименте было использовано 4 лунки с образцами и клетками (рабочая группа), 4 лунки с образцами без клеток (контрольная группа), 4 лунки с клетками и питательной средой.

Общее время культивирования составило 30 суток. Ежедневно проводили визуальные наблюдения и морфометрию во всех исследуемых группах. Визуально оценивали морфологию, характер роста клеточной культуры, наличие слущенных клеток в культуральной среде, их форму и размер, оценивали цитотоксический эффект, адгезию к материалу. Все работы проводились в ламинарном боксе «Thermo HERA safe».

Результаты эксперимента

Полученные продукты СВС имеют структуру, типичную для высокопористых материалов и состоят из трехмерных взаимопроникающих элементов: твердой матрицы и порового пространства. Матрица имеет гладкую оплавленную поверхность, характерную для материалов, образующихся в присутствии жидкой фазы. Размер пор составляет 100 ÷ 400 мкм, пористость - около 50 % . Результаты рентгенофазового анализа показали, что продукты синтеза состоят только из двух фаз: нестехиометрического карбида титана TiC_0,62 и стехиометрического никелида титана TiNi. Таким образом, увеличение температуры синтеза за счет тепла реакции образования карбида титана TiC_0,62 позволило предотвратить образование вторичных фаз. Одновременно присутствие твердых частиц тугоплавкой фазы обеспечивает структурную устойчивость горячих продуктов синтеза в поле сил тяжести.

В условиях культивирования мультипотентных мезинхимальных стромальных клеток человека с образцами во всех случаях наблюдалось визуальное увеличение количества клеток, что не отличалось от роста в контрольной группе. Данные световой микроскопии показывают, что с 1 по 4-е сутки клетки распластываются на поверхности образцов. При ежедневном наблюдении был отмечен нормальный рост культур в рабочей группе, характерный для фибробластоподобных клеток, по характеру роста и размеру не отличающихся от таковых в контрольной группе.

На 5-8-е сутки наблюдали покрытие монослоем клеток значительной площади поверхности культурального пластика в исследуемых и контрольных группах (Рис 5).

Обнаружены первые единичные клетки в порах материала, которые находятся в их просвете и фиксируются отростками к стенкам (Рис 6).

С 9-е по 13-е сутки наблюдается положительная динамика увеличения количества клеток в просвете пор. Мезинхимальные клетки сохраняют характерную морфологию, монослой на пластике полный, плотно прилегает, к образцам материала.

С 13-е по 18-е сутки наблюдали во всех порах, доступных визуальному осмотру, большие скопления клеток. Просветы мелких пор полностью закрыты, клетками. Вся площадь поверхности образцов материала покрыта клетками с высокой плотностью роста, визуально материал полностью покрыт культурами. Плотность монослоя по всей поверхности пластика не изменена (Рис 10).

С 18 по 30-е. сутки визуальная картина вокруг материала и на его поверхности, при световой микроскопии, не изменялась. На 9 день 2 образца материла – 1 контрольный и 1 рабочий были изъяты из культуральной посуды, двукратно отмыты в PBS, затем помещены в новую культуральную посуду с питательной средой без клеток. На 12 сутки в рабочей группе были обнаружены первые клетки, прикрепившиеся к поверхности пластика непосредственно возле материала. В контрольной группе клеток обнаружено не было. На 15-17 сутки в рабочей группе наблюдались значительное количество мигрировавших клеток с поверхности материала. К 21 суткам клетки образовали крупные колонии. В группе контрольного материала на протяжении всего исследования клеток обнаружено не было. На 18-е сутки произведено исследование материала и культур клеток на электронном микроскопе JEOL JSM-6390A.

Растровой микроскопии подвергали контрольные образцы без клеток и рабочие образцы с клетками.

При микроскопии на малых увеличениях, была проведена сравнительная оценка контрольного и рабочего материала (с клетками) (Рис 1 б.). Контрольный материал представлял собой пористую структуру с четко визуализированными краями и порами, без каких либо включений. На больших увеличениях (×650 и ×1400), микроструктура материала представляла спеченные между собой гранулы карбида титана с шероховатой поверхностью.

Рабочий материал был достаточно плотно покрыт структурой, напоминающей соединительно-тканную мембрану с хорошо визуализированной волокнисто клеточной структурой. При высоком увеличении до 5000х мембранной структуры, покрывающей материал, хорошо видно, что она образована большим сплетением клеток, а так же обширной сетью тонких нитевидных структур, что как мы предполагаем, может быть коллагеном. На участках, где мембрана была повреждена или отсутствовала, при большом увеличении можно было визуализировать отдельные клетки, которые росли между гранулами спеченного титана. 30-е сутки эксперимента, электронная микроскопия (Рис. 1 а.).

Рис.1а.	Рис.1б.

Наружные просветы пор и поверхность материала полностью закрыты клетками по всей площади. Клетки пролиферируют апозиционно, наслаиваясь друг на друга и образуя слоёную структуру.

Выводы

В ходе проведённого эксперимента, мы не смогли обнаружить признаки какого либо негативного воздействия СВС-материала TiC_0,5 – TiNi на клетки. Морфология клеток, скорость пролиферации, плотность межклеточных контактов оставалась аналогичной клеткам в контрольной группе. Результаты эксплант теста и электронной микроскопии позволяют дать заключение о хороших адгезивных свойствах материала. Такие наблюдения позволяют нам сделать вывод об абсолютной индифферентности СВС-материала TiC_0,5 – TiNi со сквозной пористостью, отсутствие его токсичности к культурам мезенхимальных мультипотентных стволовых клеток, хорошие адгезивные свойства клеток к поверхности материала и пролиферативную активность. Произведённые исследования позволяют рекомендовать данный материал к внедрению в клиническую практику в качестве материала для изготовления имплантатов.

Список литературы.

1.Григорьян А.С., Набиев Ф.Х., Антипова З.П. Характеристика зоны контакта эндопротеза из материала на основе графита Остек и костного фрагмента нижней челюсти. Стоматология 1996, №2, с. 4-8.

2.Григорьян А.С. Набиев Ф.Х. Барниников И.В., Хамраев Т.К. Экспериментальное обоснование возможности использования углеродной синтактической пены в челюстно-лицевой хирургии. Стоматология для всех 2002, №3, с. 24-27.

3.Щербовских А.Е. Клиническая оценка эффективности применения технологии аутологичного модифицирования дентальных имплантатов со сквозной пористостью. Современные проблемы науки и образования. 2015. № 4. С.323.

4.Щербовских А.Е. Клиническая оценка эффективности применения аутокостных модифицированных дентальных имплантатов со сквозной пористостью. Аспирантский вестник Поволжья. 2015. № 5-6. С. 309-312.

5.Щербовских А.Е. Сравнительный клинический анализ эффективности применения аутокостных модифицированных дентальных имплантатов. Современные проблемы науки и образования. 2015. № 6-0. С. 208.

6.Щербовских А.Е. Экспериментальное обоснование применения аутологичного модифицирования дентальных имплантатов на основе нетканого титанового материала со сквозной пористостью. Казанский медицинский журнал. 2015. Т. 96. № 6. С. 1000-1003.

7.Щербовских А.Е., Гафуров С.А. Обоснование аутологичного биомодифицирования нетканого титанового материала со сквозной пористостью на основе исследования напряжённо-деформированного состояния в системе «кость – дентальный имплантат». Институт стоматологии. 2015. № 1 (66). С. 86-87.

8.Щербовских А.Е., Гафуров С.А. Влияние аутологичного модифицирования дентальных имплантатов на основе нетканого титанового материала со сквозной пористостью на показатели первичной стабильности в эксперименте. Современные технологии в медицине. 2015. Т. 7. № 2. С. 62-67.

9. А.В. Лясников, А.В. Лепилин, Н.В. Бекренев, Д.С. Дмитриенко. Стоматологические имплантаты. Исследования, разработка, производство и клиническое применение. Саратов: Саратовский государственный университет 2006.-254 с.: ил.

10. Ходоренко В.Н., Ясенчук Ю.Ф., Гюнтер В.Э. Биосовместимые пористые проницаемые материалы //Биосовместимые материалы и имплантаты с памятью формы. – Томск:, Нортхэмптон, 2001. С. 9-24.

11. Ильин А.А., Гусев Д.Е., Чернышова Ю.В., Карпов В.Н., Рощина Е.А. Исследование коррозионной стойкости биоматериалов на основе титана и никелида титана // Технология лёгких сплавов, №3, 2007. с.123-130.

12. Ясенчук Ю.Ф., Гюнтер В.Э., Клопотов А.А., Чекалкин Т.Л. Исследование закономерностей формирования пористой структуры СВС-сплавов на основе TiNi // Труды Всероссийской конференции "Процессы горения и взрыва". Москва, 24-27 июня 2002 г., с. 542-546.

13. Oshima H. A study on reference standard for cytotoxicity assay of biomaterials. / H. Oshima, M. Nakamura //Biomed. Mater. Eng. 1994; V.4, №4, С.327-32.

14. Wilsnack R.E. Human cell culture toxicity testing of medical devices and correlation to animal tests. /R.E. Wilsnack , F.J. Meyer, J.G. Smith . // Biomater. Med. Devices Artif. Organs. 1973; V.1, №3, С.543-62.

15. Oshima H. A study on reference standard for cytotoxicity assay of biomaterials. / H. Oshima, M. Nakamura //Biomed .Mater. Eng. 1994; V.4, №4, С.327-32.

Код для цитирования: Скопировать