IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2017

Известно, что томатные соусы изготавливают из свежих томатов или из концентрированных полуфабрикатов с добавлением соли, сахара и пряностей. В отдельные виды соусов добавляют овощи, яблочное пюре, муку, растительное масло, пюре из сладкого перца и лимонную кислоту.

Несмотря на значительное содержание органических кислот, низкое значение pH среды и фитонцидные свойства, томатопродукты нередко подвергаются порче, возникающей в результате жизнедеятельности различных микроорганизмов. Хотя эпифитная микрофлора свежих томатов чрезвычайно разнообразна, порча томатопродуктов и консервов из томатов обусловливается, главным образом, спорообразующими микроорганизмами группы Bacillus subtilis-mesentericus и маслянокислыми облигатными анаэробами типа Clostridium butyricum [10-13]. Нами были проведены исследования по изучению показателей качества томатных соусов с применением методологических приемов, отработанных сотрудниками кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВО Ульяновская ГСХА [1-13].

Характеристика объектов исследований.

Объект исследований № 1 – соус томатный «Соус Тако нежный» – изготовитель: Santa Maria AB, Neongatan 5, SE-43121 Moindal, Швеция. – Упаковка – стеклянная банка.

Объект исследований № 2 – соус томатный для болоньезе DOLMIO® «Традиционный» - (производство Российская Федерация). – Упаковка – стеклянная банка.

Объект исследований № 3 – соус томатный с базиликом «Barilla» Domatesli Ve Feslegenli Makarna Sosi. Изготовитель: Barilla G. & R. Fratelli – SpA – Via Mantova 166, PARMA Италия. – Упаковка – стеклянная банка.

Объект исследований № 4 – соус томатный оригинальный «Хреновина» (производство Российская Федерация). – Упаковка – стеклянная банка.

Объект исследований № 5 – соус томатный «Краснодарский любительский» ТМ «Волжская элита» (производство Российская Федерация). – Упаковка – стеклянная банка.

Объект исследований № 6 – соус томатный «Краснодарский» ТМ «КУХМАСТЕР» (производство Российская Федерация). – Упаковка – стеклянная банка.

Объект исследований № 7 – соус томатный «Сацабели» ТМ «РУНА» (производство Российская Федерация). – Упаковка – стеклянная банка.

Объект исследований № 8 – соус томатный «Хреновина» ТМ «Славянский дар» (производство Российская Федерация). – Упаковка – стеклянная банка.

Термостатная выдержка – самый эффективный способ контроля доброкачественности томатных соусов. Перед микробиологическим анализом томатный соус мы выдерживали в термостате 3 суток при температуре 37 ⁰С. Непосредственно перед вскрытием томатный соус перемешивали десятикратным переворачиванием стеклянной банки с донышка на крышку. Банки с соусом томатным мы вскрывали в условиях, исключающих внесение микроорганизмов из внешней среды в консервированный продукт (в специально оборудованном боксе) после его обработки бактерицидной лампой (УФ-излучением) в течение 30 минут. Перед вскрытием упаковочный материал (крышка из полимерного материала) тщательно протирали 96 ⁰этиловым спиртом.

Для выявления КАФАнМ в две пробирки (по 5 см³) мясопептонного бульона с глюкозой вносили стерильной трубкой по 1 см³ пробы томатного соуса. Посевы выдерживали при температуре 37 ⁰С в течение 5 суток. Посевы для выявления термофильных микроорганизмов инкубировали при температуре 55-62 °С. За признаками роста наблюдали ежедневно. Нами были получены отрицательные результаты посевов на КАФАнМ: мы сделали вывод об отсутствии активно развивающихся микроорганизмов этой группы.

Выявление бацилл, вызывающих порчу продуктов питания

Первоначально каждая навеска томатного соуса была подвергнута термостатированию при 37⁰С в течение 10-18 часов для перехода споровой формы искомых бактерий в вегетативную (соотношение 1:10 в среде обогащения ((Claus, 1955)). В 100 см³ дистиллированной воды растворяли 10 г KNO₃, 5 г пептона, 3 г мясного экстракта. Устанавливали рН 7,0, разливали в пробирки по 9 мл. стерилизовали при 120°С 15 минут.

Далее из предварительно «подрощенного» материала делали ряд последовательных десятикратных разведений: 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4. 1 мл разведения высевался на чашку Петри при добавлении 9 мл мясо-пептонного агара с глюкозой и дрожжевым экстрактом температурой 38-42⁰С и производили посев штрихом на среду Донована, которую готовили без добавления полимиксина. Посевы культивировали в условиях термостата в течение 18 часов. Результаты исследований представлены в таблице 1 и показывают, что количество БВППП в исследованных пробах томатных соусов изменяется в пределах от 1,3х10²±0,8х10² КОЕ/г до 5,3х10³±2,4х10³ КОЕ/г.

Таблица 1 – Количество бактерий, выделенных из проб томатного соуса

Номер объекта исследований	Количество БВППП, КОЕ/г	Номер объекта исследований	Количество БВППП, КОЕ/г
1	3,3х102±1,6х102	5	3,4х102±0,5х102
2	2,2х102±1,0х102	6	1,3х102±0,8х102
3	1,8х102±0,5х102	7	5,3х103±2,4х103
4	4,9х102±0,7х102	8	1,6х102±0,5х102

С чашек Петри было взято для дальнейших исследований по 1-2 типичных для изучаемых бактерий колонии. Выделение «чистой культуры» проводили по методу Дригальского.

У выделенных культур были изучены тинкториальные свойства. Установлено, что все выделенные бактерии – это крупные грамположительные палочки, расположенные цепочками или попарно, кислотоустойчивые.

Затем изучаемые культуры были сгруппированы по культуральным свойствам (рост на жидкой и плотной питательных средах) в условные группы, описанные в таблице 2.

Таблица 2 – Культуральные свойства выделенных бактерий рода Bacillus

тип колоний	Характерные культуральные свойства			Количество выделенных культур одного типа
	особенности роста на мясо-пептонном агаре с глюкозой и дрожжевым экстрактом	особенности роста на мясо-пептонном бульоне
тип 1 (условная группа B. cereus)	Колонии плотной консистенции, белые, восковидные, круглые	Среда мутная, осадок трудноразбиваемый, крошковатый, прочные пленка и пристеночное кольцо. При образовании пленки среда просветляется/	2
тип 2 (условная группа B.megaterium)	Колонии слизистые, желтовато-белые	Растет в виде осадка на дне пробирки с помутнением среды	1
тип 3 (условная группа B.pumilus)	Толстые матово-белые морщинистые колонии	Бульон остается почти прозрачным, на поверхности среды морщинистая пленка	3
тип 4 (условная группа B.mycoides)	Войлоковидные наложения, ползущие по поверхности среды	Помутнения среды нет, на дне ватообразный осадок, пленки не образует	1
тип 5 (условная группа B.subtilis)	Колонии белые или сероватые, морщинистые	Бульон мутный, при образовании пленки среда просветляется	2

Следующий этап исследований был посвящен изучению биохимических свойств выделенных культур. Для типирования мы применяли ключ R.A. Slepecky, H.T. Hemphill [14], разработанный для первичной дифференциации бактерий родов BacillusиPaenibacillus(таблица 14).

Таблица 3 – Ключ для первичной дифференциации бактерий родов Bacillus

и Paenibacillus

1. Каталаза: положительный ................................................................................2 отрицательный........................................................................................................17 2. Voges-Proskauer: положительный ...................................................................3 отрицательный ......................................................................................................10 3. Рост в анаэробном агаре: положительный…………………………………...4 отрицательный........................................................................................................9 4. Рост при50°C: положительный ........................................................................5 отрицательный ......................................................................................................6 5. Рост в7% NaCl: положительный ...............................................................B.licheniformis отрицательный ................................................................................................B. coagulans 6. Кислота и газ из глюкозы (неорганический N): положительный..........B. polymyxa отрицательный......................................................................................................7 7. РедукцияNO3 доNO3: положительный...........................................................8 отрицательный ................................................................................................Paenibacillusalvei 8. Параспоральное тело в спорангии: положительный .................................. B. thuringiensis отрицательный ................................................................................................... B. cereus 9. Гидролиз крахмала: положительный............................................................ B. subtilis отрицательный.................................................................................................... B. pumilus 10. Рост при 65°C: положительный .......................................................... B. stearothermophilus отрицательный ....................................................................................................11 11. Гидролиз крахмала: положительный..........................................................12 отрицательный.....................................................................................................15 12. Кислота и газ из глюкозы (неорганический N): положительный.......B. macerans отрицательный ....................................................................................................13 13. Ширина палочки 1.0μm или больше: положительный………………B. megaterium отрицательный.....................................................................................................14 14. Рост при pH < 6.0: положительный…………..................................... B. circulans отрицательный……………………………………...................................... B. firmus 15.Рост в анаэробных условиях: положительный……............................ B. laterosporus отрицательный………………………………………….................................... 16 16.Образование кислоты из глюкозы (неорганический азот)................. B. brevis отрицательный............................................................................................. B. sphaericus .. 17. Рост при 65°C: положительный:……….............................................. B. stearothermophilus отрицательный……………………………….................................................... 18 18. Разложение казеина: положительный................................................ Р. larvae отрицательный………………………………………........................................ 19 19. Параспоральное тело в спорангии: положительный ........................ Р. popilliae отрицательный............................................................................................ B. lentimorbus

Алгоритм применения ключа: при положительном или результате определения какого-либо биохимического свойства следующий этап, рекомендованный авторами, обозначен арабской цифрой по горизонтали и отражен буквенным обозначением по вертикали. Заключительным этапом дифференциации по ключу служит название вида микроорганизма. Параллельно мы проводили исследования по дифференциации выделенных бактерий по схеме выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы (рисунок 14) по классической методике, составляющей основу идентификационных тестов для бактерий рода Bacillus в «Определителе бактерий Берджи».

На основе изученных нами биологических свойств выделенные культуры отнесли к видам Bacilluscereus, Bacillussubtilis, Bacilluspumilus(mesentericus), Bacillusmycoides, Bacillusmegaterium(рисунок 15-18). Время исследования с применением «Ключа для первичной дифференциации бактерий рода Bacillus» составило 77 часов. Исследования по схеме выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы [Error: Reference source not found] составляет 107 часов. Значительные временные и материальные затраты не позволяют применять данные методики в производственных лабораториях, в виду невозможности останавливать технологический процесс производства кондитерских изделий до получения результата бактериологического исследования с ККТ (критической контрольной точки) системы обеспечения безопасности пищевой продукции НАССР.

_{С целью оптимизации процесса идентификации бацилл, вызывающих порчу продуктов питания на примере томатного соуса, мы использовали специфические бактериофаги, выделенные и селекционированные ранее по отработанной методике фагоидентификации [2-5, 19-27].}

На поверхность подсушенного мясопептонного агара в чашках Петри пастеровской пипеткой наносили 3-4 капли бульонной 10 часовой культуры исследуемых микроорганизмов. Нанесённую культуру равномерно распределяли по поверхности среды стерильным шпателем. Чашки ставили в термостат для подсушивания газона культуры на 20-30 минут при 37 ⁰С.

Чашку делили бактериологическим карандашом на шесть секторов. На поверхность засеянной среды, в зоне первого-пятого секторов, пастеровской пипеткой легким прикосновением капли наносили фаги, на шестой сектор в качестве контроля наносили стерильный мясопептонный. Наклоняли чашку, чтобы капли стекли в виде дорожки. Чашки оставляли для подсушивания в боксе на 20-30 минут и помещали в термостат на 18 часов при 37 ⁰С.

Таблица 15 – Эффективность методов идентификации бактерий рода Bacillus

Методы идентификации бактерий	Время исследования, час	Вид бактерий
		B. cereus	B.megaterium	B.pumilus	B.mycoides	B.subtilis
Фагоидентификация	29	2	1	3	1	2
«Ключ для первичной дифференциации бактерий рода Bacillus»	77	2	1	3	1	2
Схема выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы	107	2	1	3	1	2

Результат исследований считали положительным, если на месте нанесения фагов на газоне сплошного роста культуры образовывалась прозрачная зона лизиса с возможно вторичным ростом фагорезистентных микроорганизмов или без него, а также рост негативных колоний фага. Отрицательным считали результат – отсутствие лизиса на газоне роста исследуемой культуры микроорганизмов и отсутствие лизиса в контроле. При положительном результате культуру относили к тому виду бактерий, для которого специфичен «сработавший» бактериофаг.

В таблице 15 представлены результаты фагоидентификации выделенных нами бактерий в сравнении с двумя ранее применямыми нами методиками.

 

Ресуспендирование материала в МПБ

Подготовка исследуемого материала в соответствии с НТД

5 ч 24 ч 5 ч 25 ч

 

 

21 час

 

 

Прогревание в течение 30 минут при 70-75 ⁰ С и пересев на МПА

 

 

Прогревание в течение 45 минут при 80 ⁰С и пересев на среду Донована без полимиксина и мясо-пептонного агара с глюкозой и дрожжевым экстрактом

 

 

Пересев на мясо-пептонный бульон и культивирование в условиях термостата

 

 

8 часов

 

 

Фагоиденфикация методом «стекающая капля»

Среда Гаузе № 2, среда Громыко, МПА

 

 

Окраска по Граму, пересев на МПБ, инкубированиев термостате

 

 

Учет результатов по наличию или отсутствию дорожек лизиса на газоне исследуемой культуры

 

 

24 ч 24 ч

Среда Кларка,

МПБ+7 % NaCl,

1% глюкозный агар, картофельный агар,

среда с мочевиной,

молочный агар,

тирозиновый агар,

МПА, кукурузно-петонный агар, среда Омелянского с глюкозой, МПБ с индикаторными бумажками на сероводород, индол и аммиак

мясо-пептонный желатина,

МПБ с яичным желтком, МПБ с нитратами в анаэростате

 

Итого: 29 часов (I)

 

Постановка реакции на каталазу, Фогес-Проскауер; рост при 50 и 65 °С; гидролиз крахмала; рост в анаэробных условиях, образование кислоты и газа из глюкозы, микроскопия мазка (ширина палочки 1.0μm или больше), рост в 7 % NaCl, разложение казеина, рост при рН

Код для цитирования: Скопировать