СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ КРЫС - Студенческий научный форум

IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2017

Личный портфель

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ КРЫС

Барков С.Ю. 1
1Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера
 Комментарии
Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
Для исследования фагоцитарной активности лейкоцитов применяются различные методы: микроскопические [1, 3, 5, 6, 7], радиоизотопные [3] и флюориметрические. Одной из проблем для последних двух групп методов является сложность отделения поглощенных объектов фагоцитоза от нефагоцитированных меченых флюорохромами объектов фагоцитоза [2, 4].

Цель исследования – сравнительная оценка методов исследования фагоцитарной активности лейкоцитов крови крыс с помощью проточной лазерной цитометрии с использованием зимозана A (Sacchromycescervisisae), меченого флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ), и с использованием зимозана, меченого маркером ацидификации фагосом green pHrodoTM, сопоставить полученные результаты с данными микроскопического анализа параллельных проб.

Материалы и методы. Эксперимент проводили на нелинейных белых крысах-самцах. Лейкоциты гепаринизированной (50 ЕД/мл) крови выделяли седиментацией с 0,2% метилцеллюлозой (Sigma-Aldrich, США) в равных объемах. Полученную суспензию лейкоцитов в объеме 4 мкл добавляли к 88 мкл полной питательной среды (ППС, среда RPMI-1640 с добавлением 10 мМ HEPES, 2 мМ GlutaMAXTM, 1 мМ пирувата натрия, 1% заменимых аминокислот в MEM, все Gibсо®, Life TechnologiesTM) после чего вносили 8 мкл преинкубированной в течение 30 мин при 370С смеси равных объёмов аутоплазмы и частиц зимозана, меченых ФИТЦ (100×106 частиц/мл) или маркером ацидификации фагосом green pHrodoTM(Molecular Probes® / Life Technologies). Зимозан, меченый ФИТЦ, готовили по методу [8]. Пробы перемешивали на вортексе и инкубировали в течение 30 и 120 мин при 370С.Смесь клеток доводили до объёма 250 мкл стоп - реагентом и вносили в 96-луночный плоскодонный планшет для ИФА («Медполимер», Санкт-Петербург), далее проводили анализ на проточном цитометре Millipore Guava Easycyte. Анализ микроскопических препаратов проводили по методу [3] дифференцированно для нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов. При подсчете учитывали число фагоцитирующих клеток и количество поглощенных объектов фагоцитоза.

Результаты. Исследованы методы оценки фагоцитарной активности с использованием ФИТЦ, и маркером ацидификации фагосом pHrodoTM Выполнена оценка количества флюоресцирующих и не флюоресцирующих клеток. Уровень флюоресцирующих клеток отражает фагоцитарную активность.

Выводы. Выявлено, что использования маркера ацидификации фагосом pHrodoTM более точно отражает фагоцитарную активность, в сравнении с ФИТЦ.

Список литературы:

  1. Шилов С.Ю. Влияние орхидэктомии на стрессорные изменения количественного состава лейкоцитов и фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови самцов крыс // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2011. - № 4/1 (38). -С. 160-161.

  2. Шилов С.Ю., Жукова А.Е., Петухова А.А., Барков С.Ю., Шилов Ю.И. Оценка фагоцитарной активности перитонеальных клеток и лейкоцитов крови крыс с использованием маркера ацидификации фагосом pHrodoTM // Российский иммунологический журнал. - 2015. - Том 9(18), № 2(1). - С. 352-354.

  3. Шилов Ю.И., Владыкина В.П., Атнагузина А.Т. Некоторые методические подходы к оценке показателей общего и дифференцированного фагоцитоза лейкоцитов периферической крови. Характеристика различий у здоровых людей // Пермский мед. журнал. - 1998. - Т. 15, № 2. - С. 3-6.

  4. Шилов Ю.И., Шилов С.Ю., Жукова А.Е., Барков С.Ю., Петухова А.А. Изменение уровня ацидификации фагосом у крыс в зависимости от фазы эстрального цикла // Российский иммунологический журнал. - 2016. - Т. 10 (19), № 2 (1). - С. 183-184.

  5. Шилов Ю.И., Шилов С.Ю., Валиева Ю.В. Изменения нейтрофильного фагоцитоза при старении самцов и самок крыс и введении им дегидроэпиандростерона // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2014. - № 3. - С. 47-48.

  6. Шилов Ю.И., Орлова Е.Г., Ланин Д.В., Шилов С.Ю. Роль адренергических механизмов в реализации иммуномодулирующих эффектов глюкокортикоидов при стрессе // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2004. - № 4. – С. 87-93.

  7. Shilov Ju.I., Lanin D.V., Shilov S.Ju., Orlova E.G. Influence of beta-adrenergic receptor blockade on immunomodulatory effects of hydrocortisone // New Research on Immunology / Ed. by Barbara A. Veskler / Nova Biomedical Books. - New York: Nova Science Publishers, Inc., 2005. (ISBN 1-59454-289-9). (Chapter 7). - P. 167-191.

  8. Winyard, P. G., Willoughby, D. A. (Eds.). Inflammation protocols. New York: Humana Press. 2003. Vol. 225. P. 39

Просмотров работы: 294