IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2017

Врач любой специальности должен использовать достижения медицинской генетики для профилактики, диагностики и лечения заболеваний.

Профилактика врожденной и наследственной патологии включает в себя 3 уровня:

• периконцепционная профилактика

• пренатальная диагностика

• неонатальный скрининг

Периконцепционная профилактика – это обеспечение оптимальных условий для созревания яйцеклетки, ее имплантации и раннего развития плода.

Рекомендуетсявсем супружеским парам, планирующим беременность. Для этого им необходимо поддерживать ЗОЖ, женщинам принимать фолиевую кислоту, отказаться от курения.

Пренатальная диагностикавключает в себя различные методы исследования плода с целью ранней диагностики наследственных болезней и пороков развития.

Неинвазивные методы:

• УЗИ плода (I, II, III триместр беременности)

• определение сывороточных маркеров матери

Инвазивные методы:

• биопсия ворсин хориона (10-14 недель)

• плацентоцентез (12-16 недель)

• амниоцентез (12-18 недель)

• кордоцентез (с 20 недели)

Взятый материал анализируется с помощью различных лабораторных методов. К ним относятся:

• цитогенетическая диагностика

• иммуноферментный анализ

• биохимическая диагностика

• молекулярно-цитогенетический анализ (FISH)

• молекулярно-биологический анализ (ДНК)

Неонатальный скрининг проводится в рамках Национального проекта “Здоровье”. Этот этап включает в себя диагностику 5 наследственных патологий:

• фенилкетонурия

• врожденный гипотиреоз

• муковисцидоз

• адрено-генитальный синдром

• галактоземия

Для этого у новорожденного берется кровь из пятки и направляется на первичную диагностику в МГК, а затем подтверждается ДНК-диагностикой.

Методы ДНК-диагностики делятся на прямые и косвенные. Прямые определяют мутации, являющиеся непосредственной причиной заболевания. Косвенные определяют хромосомы, несущие поврежденный ген, при семейном анализе.

Существует множество методов ДНК-диагностики. В Оренбурге используют Анализ ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) и Real-time ПЦР.

С помощью ДНК-диагностики диагностируются различные наследственные патологии, из них в Оренбургской МГК диагностируются НС тугоухость типа DFNB1, фенилкетонурия, адреногенитальный синдром, муковисцидоз, миодистрофия Дюшенна/Беккера, спинальная амиотрофия, болезнь Шарко- Мари-Тута.

Хромосомные патологии традиционно диагностируются с помощью кариотипирования. Но кариотипирование имеет ряд недостатков:

• необходимо культивирование клеток

• не выявляет микроделеции, дупликации, низкоуровневый мозаицизм.

Эти недостатки устраняются современными молекулярно-цитогенетическими методами. К ним относят:

• флюоресцентную гибридизацию in situ (FISH), разработанную в 1986 г. Пинкелем.

• метод сравнительной геномной гибридизации (CGH), разработанный в 1922 г. Калионейме.

Принцип методафлуоресцентной гибридизации in situ заключается в том, чтоиспользуют ДНК-зонды, меченные флюорохромом, комплементарные определенным участкам генома человека. ДНК пациента денатурирует, т.е. разделяется на 2 цепочки и к ней добавляют ДНК-зонд (рис.1). Если присутствует комплементарный участок, то происходит гибридизация. Затем флуоресцентный сигнал регистрируется с помощью микроскопа. Отсутствие сигнала свидетельствует о потере участка генома.

Рис.1 Флуоресцентная гибридизация in situ.

Недостатком метода являетсяисследование только заранее определенной области генома

Существуют различные виды ДНК-зондов для флуоресцентной гибридизации in situ (рис.2):

1. центромероспецифичные зонды для выявления анеуплоидий, мозаицизма и сверхчисленных хромосом;

2. локус специфические зонды для выявления микроделеций, амплификаций, исследования сложных хромосомных перестроек;

3. транслокации выявляются с помощью полнохромосомных зондов;

Рис.2 Виды ДНК-зондов для флуоресцентной гибридизации in situ.

Сбалансированную транслокацию выявляют с помощью FISH-painting (рис.3). Для выявления хромосомных аббераций используют зонды на целую хромосому или хромосомные плечи.

Рис.3 FISH-painting. Зеленый сигнал - материал хромосомы 5, красный сигнал - материал хромосомы 20, комбинированный сигнал – сбалансированная транслокация.

Для диагностики синдрома Прадера-Вилли и Ангельмана используют локус-специфические зонды (рис.4).

Рис.4 Локус-специфический зонд: а – нормальная хромосома с 3 сигналами, б-del(15)(q11.2-q13) с 2 сигналами.

Одним из преимуществ метода флуоресцентной гибридизации in situ является возможность использования неделящихся клеток. ИнтерфазнаяFISH используется для предимплантационной диагностики в ЭКО и занимает всего 2-3 часа.

Очередную революцию в цитогенетике произвела разработка метода сравнительной геномной гибридизации (CGH). Данный метод позволяет провести одновременный анализ всего генома человека на наличие избытка или недостатка генетического материала.

CGH основана на сравнении тестируемой и контрольной ДНК, меченных разными флуорохромами, которые смешиваются в соотношении 1:1 и гибридизуются на метафазных хромосомах кариотипически здорового человека. С помощью специального сканера анализируется интенсивность флуоресцентного сигнала (рис. 5).

Рис.5 Метод сравнительной геномной гибридизации (CGH)

В настоящее время используют усовершенствованный метод CGH на микрочипах. Этот метод отличается тем, что меченная ДНК наносится не на метафазные хромосомы, а на специализированную матрицу, которая содержит образцы фрагментированной ДНК генома человека (рис.6).

Рис.6 CGH на микрочипах. 1-2:ДНК пациента (опытная) и ДНК здорового индивидуума (контрольная) метятся различными флуорохромами (Cy3 и Cy5) и наносятся на микрочип. 3: Конкурентная гибридизация

опытной и контрольной ДНК с ДНК-зондами на микрочипе. 4:Измерение флуоресцентного сигнала (соотношение интенсивности флуресценции Сy3/Cy5) с использованием сканнера для микрочипов. 5:Анализ полученных данных с использованием компьютерной программы и получение графического изображения.

Преимуществом метода CGHявляется:

• возможность использования малого количества ДНК, а также использования архивного материала;

• процесс автоматизирован и исключает субъективные ошибки;

• позволяет выявить все структурные перестройки за один эксперимент;

• 1 анализ array CGH эквивалентен 1000 FISH-анализам;

Поскольку CGH выявляет только количественные изменения ДНК, то им невозможно диагностировать точковые мутации и сбалансированные транслокации.

Модификацией CGH является Хромосомный микроматричный анализ. Данный метод зарегистрирован в России как медицинский тест в 2012 году. Он позволяет выявить все микроделеции и микродупликации в геноме за 1 эксперимент. Выполняется в лаборатории молекулярной патологии «Геномед». Данный метод позволяет выявить генетическую причину большинства отклонений в развитии детей. Но он не выявляет сбалансированные транслокации.

Для иллюстрации практического значения метода рассмотрим клинический случай:

Пациент К., девочка 8 лет.

Клиническая картина: выраженная задержка развития, микроцефалия, низкий рост. На МРТ – множественные мелкие внутримозговые кальцинаты.

Кариотип: 46,ХХ; мутации в гене ERCC6, приводящие к синдрому Коккейна не обнаружены.

Обнаружена микроделеция на длинном плече 5 хромосомы, захватывающая 10-12 экзоны гена ERCC8.

Таким образом, современные методы диагностики на сегодняшний день позволяют выявить качественные и количественные изменения генотипа на любом уровне. Однако проблема ранней диагностики, а, следовательно, и профилактики наследственной патологии далеко не решена, поскольку в настоящее эти методы доступны только на уровне крупных федеральных центров, таких как Медико-генетический научный центр РАМН(Москва, Москворечье, 1 МГНЦ РАМН).

Выражаю благодарность за помощь в написании статьи моему научному руководителю доценту кафедры биологии ОрГМУ кандидату биологических наук Фабарисовой Л.Г.

Код для цитирования: Скопировать