Профилактика врожденной и наследственной патологии включает в себя 3 уровня:
периконцепционная профилактика
пренатальная диагностика
неонатальный скрининг
Периконцепционная профилактика – это обеспечение оптимальных условий для созревания яйцеклетки, ее имплантации и раннего развития плода.
Рекомендуетсявсем супружеским парам, планирующим беременность. Для этого им необходимо поддерживать ЗОЖ, женщинам принимать фолиевую кислоту, отказаться от курения.
Пренатальная диагностикавключает в себя различные методы исследования плода с целью ранней диагностики наследственных болезней и пороков развития.
Неинвазивные методы:
УЗИ плода (I, II, III триместр беременности)
определение сывороточных маркеров матери
Инвазивные методы:
биопсия ворсин хориона (10-14 недель)
плацентоцентез (12-16 недель)
амниоцентез (12-18 недель)
кордоцентез (с 20 недели)
Взятый материал анализируется с помощью различных лабораторных методов. К ним относятся:
цитогенетическая диагностика
иммуноферментный анализ
биохимическая диагностика
молекулярно-цитогенетический анализ (FISH)
молекулярно-биологический анализ (ДНК)
Неонатальный скрининг проводится в рамках Национального проекта “Здоровье”. Этот этап включает в себя диагностику 5 наследственных патологий:
фенилкетонурия
врожденный гипотиреоз
муковисцидоз
адрено-генитальный синдром
галактоземия
Для этого у новорожденного берется кровь из пятки и направляется на первичную диагностику в МГК, а затем подтверждается ДНК-диагностикой.
Методы ДНК-диагностики делятся на прямые и косвенные. Прямые определяют мутации, являющиеся непосредственной причиной заболевания. Косвенные определяют хромосомы, несущие поврежденный ген, при семейном анализе.
Существует множество методов ДНК-диагностики. В Оренбурге используют Анализ ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) и Real-time ПЦР.
С помощью ДНК-диагностики диагностируются различные наследственные патологии, из них в Оренбургской МГК диагностируются НС тугоухость типа DFNB1, фенилкетонурия, адреногенитальный синдром, муковисцидоз, миодистрофия Дюшенна/Беккера, спинальная амиотрофия, болезнь Шарко- Мари-Тута.
Хромосомные патологии традиционно диагностируются с помощью кариотипирования. Но кариотипирование имеет ряд недостатков:
необходимо культивирование клеток
не выявляет микроделеции, дупликации, низкоуровневый мозаицизм.
Эти недостатки устраняются современными молекулярно-цитогенетическими методами. К ним относят:
флюоресцентную гибридизацию in situ (FISH), разработанную в 1986 г. Пинкелем.
метод сравнительной геномной гибридизации (CGH), разработанный в 1922 г. Калионейме.
Принцип методафлуоресцентной гибридизации in situ заключается в том, чтоиспользуют ДНК-зонды, меченные флюорохромом, комплементарные определенным участкам генома человека. ДНК пациента денатурирует, т.е. разделяется на 2 цепочки и к ней добавляют ДНК-зонд (рис.1). Если присутствует комплементарный участок, то происходит гибридизация. Затем флуоресцентный сигнал регистрируется с помощью микроскопа. Отсутствие сигнала свидетельствует о потере участка генома.
Рис.1 Флуоресцентная гибридизация in situ.
Недостатком метода являетсяисследование только заранее определенной области генома
Существуют различные виды ДНК-зондов для флуоресцентной гибридизации in situ (рис.2):
центромероспецифичные зонды для выявления анеуплоидий, мозаицизма и сверхчисленных хромосом;
локус специфические зонды для выявления микроделеций, амплификаций, исследования сложных хромосомных перестроек;
транслокации выявляются с помощью полнохромосомных зондов;
Рис.2 Виды ДНК-зондов для флуоресцентной гибридизации in situ.
Сбалансированную транслокацию выявляют с помощью FISH-painting (рис.3). Для выявления хромосомных аббераций используют зонды на целую хромосому или хромосомные плечи.
Рис.3 FISH-painting. Зеленый сигнал - материал хромосомы 5, красный сигнал - материал хромосомы 20, комбинированный сигнал – сбалансированная транслокация.
Для диагностики синдрома Прадера-Вилли и Ангельмана используют локус-специфические зонды (рис.4).
Рис.4 Локус-специфический зонд: а – нормальная хромосома с 3 сигналами, б-del(15)(q11.2-q13) с 2 сигналами.
Одним из преимуществ метода флуоресцентной гибридизации in situ является возможность использования неделящихся клеток. ИнтерфазнаяFISH используется для предимплантационной диагностики в ЭКО и занимает всего 2-3 часа.
Очередную революцию в цитогенетике произвела разработка метода сравнительной геномной гибридизации (CGH). Данный метод позволяет провести одновременный анализ всего генома человека на наличие избытка или недостатка генетического материала.
CGH основана на сравнении тестируемой и контрольной ДНК, меченных разными флуорохромами, которые смешиваются в соотношении 1:1 и гибридизуются на метафазных хромосомах кариотипически здорового человека. С помощью специального сканера анализируется интенсивность флуоресцентного сигнала (рис. 5).
Рис.5 Метод сравнительной геномной гибридизации (CGH)
В настоящее время используют усовершенствованный метод CGH на микрочипах. Этот метод отличается тем, что меченная ДНК наносится не на метафазные хромосомы, а на специализированную матрицу, которая содержит образцы фрагментированной ДНК генома человека (рис.6).
Рис.6 CGH на микрочипах. 1-2:ДНК пациента (опытная) и ДНК здорового индивидуума (контрольная) метятся различными флуорохромами (Cy3 и Cy5) и наносятся на микрочип. 3: Конкурентная гибридизация
опытной и контрольной ДНК с ДНК-зондами на микрочипе. 4:Измерение флуоресцентного сигнала (соотношение интенсивности флуресценции Сy3/Cy5) с использованием сканнера для микрочипов. 5:Анализ полученных данных с использованием компьютерной программы и получение графического изображения.
Преимуществом метода CGHявляется:
возможность использования малого количества ДНК, а также использования архивного материала;
процесс автоматизирован и исключает субъективные ошибки;
позволяет выявить все структурные перестройки за один эксперимент;
1 анализ array CGH эквивалентен 1000 FISH-анализам;
Поскольку CGH выявляет только количественные изменения ДНК, то им невозможно диагностировать точковые мутации и сбалансированные транслокации.
Модификацией CGH является Хромосомный микроматричный анализ. Данный метод зарегистрирован в России как медицинский тест в 2012 году. Он позволяет выявить все микроделеции и микродупликации в геноме за 1 эксперимент. Выполняется в лаборатории молекулярной патологии «Геномед». Данный метод позволяет выявить генетическую причину большинства отклонений в развитии детей. Но он не выявляет сбалансированные транслокации.
Для иллюстрации практического значения метода рассмотрим клинический случай:
Пациент К., девочка 8 лет.
Клиническая картина: выраженная задержка развития, микроцефалия, низкий рост. На МРТ – множественные мелкие внутримозговые кальцинаты.
Кариотип: 46,ХХ; мутации в гене ERCC6, приводящие к синдрому Коккейна не обнаружены.
Обнаружена микроделеция на длинном плече 5 хромосомы, захватывающая 10-12 экзоны гена ERCC8.
Таким образом, современные методы диагностики на сегодняшний день позволяют выявить качественные и количественные изменения генотипа на любом уровне. Однако проблема ранней диагностики, а, следовательно, и профилактики наследственной патологии далеко не решена, поскольку в настоящее эти методы доступны только на уровне крупных федеральных центров, таких как Медико-генетический научный центр РАМН(Москва, Москворечье, 1 МГНЦ РАМН).
Выражаю благодарность за помощь в написании статьи моему научному руководителю доценту кафедры биологии ОрГМУ кандидату биологических наук Фабарисовой Л.Г.