IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2017

Введение.

Биотехнологические методы в селекции растений стали применятся примерно с середины минувшего столетия, и значение их непрерывно возрастает, поскольку биотехнологии под силу задачи, которые традиционными методами решить невозможно или чрезвычайно трудно. Уже сейчас достигнуты впечатляющие результаты: миллионы гектаров в мире занимают ежегодно сортами и гибридами полученными с помощью биотехнологий.

Отличительным признаком биотехнологических методов, используемых в селекции растений, является манипуляции in vitro. Все методы биотехнологии могут в той или степени могут быть использованы в практической работе как на отдельном ее этапе селекции, самостоятельно или комплектно в зависимости от задач и степени кооперации селекционеров или биотехнологов.

Основные селекционные задачи, решаемые с помощью методов биотехнологии следующие: - создание нового исходного материала для селекции; - снижение трудоемкости селекционных работ за счет уменьшения популяции для отбора; - ускорение селекционного процесса за счет быстрого получения гомозиготных генотипов после проведения скрещивания или получения самоопыленных линий при селекции гетерозисных гибридов; - повышение эффективности отбора ценных генотипов и постоянного контроля за наличием их в отбираемом селекционном материале.

В селекции растений используют две группы биотехнологических методов. Первая группа – методы культуры клеток и тканей.

Вторая группа – методы генной инженерии.

1. Методы культуры клеток и тканей.

Существуют три вида культуры клеток и тканей: - каллусная культура; - культура клеток и агрегатов клеток; - культура протопластов.

Для проведения работ по клеточной селекции растений в условиях in vitro в качестве объекта исследования могут быть использованы каллусные, суспензионные культуры или изолированные протопласты. Выбор объекта зависит от наличия разработанных технологий применительно к различным видам растений, а также от конечных целей исследования.

Каллусная ткань представляет собой легко доступный материал, который наиболее часто используют для клеточной селекции. Как правило, работу проводят на первичной или переса­дочной каллусной ткани, которая не утрачивает способности к регенерации на протяжении ряда субкультивирований. Однако при работе с каллусными культурами многие исследователи отмечают существенные недостатки данного объекта: медленный рост ткани, неравноценное для всех клеток действие токси­ческих веществ, которые применяются в качестве селективного фактора, а также потеря регенерационной способности в процессе культивирования каллусных клеток. Несомненно, проводить селекцию целесообразно на уровне одиночных клеток (суспензионная культура, протопласты). Однако для многих видов растений не разработаны эффективные технологии и способы культивирования одиночных клеток. Поэтому, несмотря на пе­речисленные выше недостатки использования каллусных культур, этот способ селекции остается для некоторых видов растений пока единственным.

Получение стабильно устойчивых линий — процесс длительный. Как правило, селекция начинается с получения достаточного количества каллусной массы из изолированных растительных эксплантов, использующейся в дальнейшем для определения концентрации селективного фактора (построение дозовой кривой), при которой наблюдается одновременно рост каллусной ткани, и в то же время часть каллусных колоний погибает. Выбранная концентрация селективного фактора признается оптимальной и используется в дальнейших экспериментах. Так как первично полученные на средах с селективными факторами колонии клеток могли возникнуть вследствие физиологической адаптации или определенного состояния дифференцировки клеток и не быть генетически устойчивыми, то в течение последующих 4—6 субкультивирований на селективной среде проверяет­ся стабильность устойчивости полученных клонов. Затем их переносят на среду без селективного фактора и субкультивируют еще 2—3 пассажа. И только после повторного возвращения в селективные условия отбирают стабильные клоны, из которых пытаются получить растения-регенеранты. Однако работы, проведенные с получением растений, устойчивых к повышенным солям, а также к токсинам, выделенным из грибов—возбудителей болезней, показали, что устойчивость клетки и растения к исследуемому селективному фактору может совпадать и не совпадать. Прямая корреляция между устойчивостью растений и клеток in vitro отмечена лишь для низких температур, устойчивостью к гербицидам, высоким концентрациям алюминия и другим факторам.

Большое число работ по культивированию каллуса, с целью получения нового селекционного материала, проведено на пшенице, ячмене, рисе, сорго, а также на картофеле, томатах, люцерне и, крайне редко, на древесных. Уже достигнуты первые положительные результаты по получению растений пшеницы, риса, картофеля, устойчивых к NaCI или Na₂S0₄. Получены клетки, а из них растения моркови, которые синтезируют в 20 раз больше метионина, в 30 раз — триптофана, в 5 раз — лизина путем добавления в питательную среду токсичных аналогов аминокислот. Для картофеля получены растения, устойчивые к кольцевой гнили. Что касается древесных, то для них работы в этом направлении крайне редки и часто имеют поисковый характер. Таким образом, использование каллусной культуры в селекционных целях открывает огромные возможности в создании новых форм растений, несущих ценные признаки, необходимые для человечества.

Наряду с перечисленными выше объектами (каллусная, суспензионная культура, изолированные протопласты), в качестве исходного материала для селекции могут быть использованы культуры соматических или андрогенных эмбриоидов, такие органогенные экспланты, как сегменты листьев или различные меристематические и стеблевые части растений, а также культура изолированных зародышей. Например, путем культивиро­вания и селекции in vitro зародышей из семян получены растения ячменя, устойчивые к аналогам аминокислот, с улучшенным содержанием белка. Для картофеля разработан эффективный метод обработки побегов и черенков мутагеном, приводивший к получению химерных мутантов хлорофиллдефектности и антибиотикоустойчивости. При культивировании пыльников яровой пшеницы сорта Саратовская-29 и Московская-35 на питательных средах с повышенным содержанием солей хлорида натрия получены соматические эмбриоиды, а в дальнейшем растения-регенеранты, проявившие повышенную солеустойчивость (Беккужина, 1993).

Таким образом, проведение селекции на клеточном уровне позволяет создавать новые формы растений в 2—4 раза быстрее по сравнению с традиционными способами селекции.

1.1 Селекция растений на клеточном уровне.

Значительный интерес представляет вопрос об использовании клеточной селекции в комплексе с получением сомаклонов. Одна из наиболее сильных сторон культуры invitro в создании технологий для сельского хозяйства – возможность на основе сомаклональных вариаций или индуцированных мутаций отбирать в жестких селективных условиях клетки, характеризующиеся искомыми признаками.

Для проведения клеточной селекции используют следующие приемы:

— прямая (позитивная) селекция, при которой выживает лишь определенный искомый мутантный тип клеток;

— непрямая (негативная) селекция, основанная на избирательной гибели делящихся клеток дикого типа и выживания метаболически неактивных клеток, но требующая дополнительной идентификации у них мутационных изменений;

— тотальная селекция, при которой индивидуально тестируются все клеточные клоны;

— визуальная селекция и неселективный отбор, когда вариантная линия может быть идентифицирована среди всей популяции клеток визуально или при использовании биохимических методов (тонкослойная или жидкостная хроматография, радиоиммунный анализ, микроспектрофотометрия и др.).

1.2. Получение гаплоидов in vitro и использование их в селекции.

Роль гаплоидных растений в селекции очень велика. Применение их позволяет быстрее найти нужную комбинацию, сокращает время для создания сорта. Гаплоиды используются для получения стабильных гомозиготных линий. Для мутагенеза также удобнее использовать гаплоиды, поскольку на гаплоидном уровне облегчается отбор рецессивных мутаций.

В диплоидных растениях мутации редко затрагивают оба аллельных гена в гомологичных хромосомах. Особь обычно гетерозиготна (два гена различаются), при этом проявляется действие только доминантного (но не рецессивного) гена. Поскольку мутации чаще рецессивны, чем доминантны, их довольно сложно выявить. В гаплоидных же растениях, которые содержат только одну из каждой пары гомологичных хромосом, мутации проявляются немедленно. Селекция на гаплоидном уровне позволяет вести прямой отбор не только доминантных, но и рецессивных признаков.

Гаплоидные особи стерильны, но можно искусственно удвоить набор их хромосом с помощью колхицина и получить диплоидные гомозиготные растения.

Гаплоиды могут возникать спонтанно, но частота их спонтанного возникновения очень мала. Искусственным путем с Использованием методов in vitro удается получить большие количества гаплоидных растений. Существует три способа получения гаплоидов с использованием метода культуры изолированных тканей:

андрогенез – получение гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных пыльников и микроспор.

гиногенез – получение гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных семяпочек;

партеногенез – получение гаплоидов из гибридного зародыша, у которого из-за несовместимости хромосом родителей потеряны отцовские хромосомы.

Образовавшиеся в результате элиминации хромосом отцовского генома гаплоидные эмбриоиды культивируют на искусственных питательных средах и получают гаплоидные растения. Сорта ячменя Исток и Одесская-15 были получены комбинацией партеногенетического метода с культурой изолированных зародышей за четыре года вместо обычных 10–12 лет. Методом культуры пыльников из сортов и гибридов мягкой и твердой пшеницы в НПО «Элита Поволжья» за четыре года получено более 2,5 тыс. дигаплоидных линий, которые характеризуются гомогенностью и стабильностью.

Продолжается разработка технологии получения гаплоидов посредством культуры пыльников пшеницы, ячменя, кукурузы, озимой ржи, картофеля. В культуре пыльников возможны два пути образования гаплоидных растений. Первый – образование растений путем эмбриогенеза в пыльцевых зернах. При этом внутри пыльников из отдельных пыльцевых зерен возникают эмбриоиды. Они прорастают и дают гаплоидные растения. Второй – образование каллуса из клеток пыльника. В дальнейшем в результате морфогенеза из каллусных клеток регенерируют растения. В этом случае образовавшиеся растения не всегда бывают гаплоидными и часто отличаются по плоидности. До конца не выяснено, образуются ли они от полиплоидизированных гаплоидных клеток или от слившихся клеток.

Гаплоиды, полученные in vitro, могут применяться не только в практической селекции, но и в работах по генетической инженерии, а также по клеточной селекции. Пыльцевые зерна являются в некоторых случаях более удобными, чем протопласты, объектами для опытов по генетической трансформации.

1.3. Микроклональное размножение растений in vitro.

Клональным микроразмножением называют неполовое размножение растений с помощью метода культуры тканей, позволяющее получать растения идентичные исходному. В основе получения таких растений лежит способность соматических клеток растений полностью реализовывать свой потенциал развития, т.е. свойство тотипотентности. Метод клонального микроразмножения получает все более широкое распространение во всем мире. В большинстве стран эта технология приобрела коммерческий характер.

Обязательное условие клонального микроразмножения — использование объектов, полностью сохраняющих генетическую стабильность на всех этапах процесса, от экспланта до растений в поле. Такому требованию удовлетворяют апексы и пазушные почки органов стеблевого происхождения, т. е. меристематические ткани. Их устойчивость к генетическим изменениям, вероятно, связана с высокой активностью систем репарации ДНК, а также с негативной селекцией измененных клеток.

Процесс клонального микроразмножения можно подразделить на 3 этапа:

1. Получение хорошо растущей стерильной культуры. На этом этапе необходимо правильно выбрать растение-донор, получить свободную от инфекции культуру, добиться ее выживания и быстрого роста на питательной среде.

2. Собственно размножение, осуществляемое несколькими способами:

· активизация пазушных меристем;

· индукция образования адвентивных почек тканями листа, стебля, чешуйками и донцем луковиц, корневищем и зачатками соцветий без первоначального образования каллусной ткани;

· микрочеренкование побега, сохраняющего апикальное доминирование;

· стимуляция образования микроклубней и микролуковичек;

· индукция соматического эмбриогенеза.

3. Подготовка к высадке в поле или к реализации. Это очень важный этап, во время которого в теплице укорененные растения, полученные in vitro, адаптируют к новым условиям внешней среды: проводят закаливание растений, повышают их устойчивость к патогенным микроорганизмам и различным неблагоприятным факторам внешней среды. Существует много различных способов адаптирования растений к пересадке in vivo. Это подбор почвенного субстрата, создание определенной влажности, обработка химическими веществами (глицерин, парафин) для предотвращения обезвоживания листьев. Некоторые древесные растения лучше приживаются, если их заразить in vitro микоризообразующими грибами. Упрощенный способ адаптации пробирочных растений винограда был разработан в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН. Адаптацию проводят прямо в пробирках, снимая с них пробки, когда растения винограда дорастают до верха пробирки. Через 1,5—2 недели, когда верхушки побега с двумя развитыми листьями появляются над пробиркой, растение готово к пересадке в почву. Для предотвращения механических повреждений корневой системы растение пересаживают в почву вместе с агаром, заглубляя его так, что над поверхностью почвы остаются только 2 развитых листа, которые выросли из пробирки и уже адаптировались к внешним условиям. Такая методика позволяет значительно упростить, ускорить и удешевить этап акклиматизации растений.

Клональное микроразмножение растений проводят разными способами. Первый и основной способ — активизация пазушных меристем. Он состоит в снятии апикального доминирования и активизации развития меристем, существующих в растении. Этот способ основной и в обычном вегетативном размножении. И на интактном растении, и в случае клонирования снятие апикального доминирования достигается или удалением апикальной меристемы побега, или благодаря действию цитокинина. При клонировании цитокинины (6-бензиламинопурин, 6-фурфуриламинопурин, зеатин) добавляют в питательную среду, что приводит к развитию многочисленных пазушных побегов. Эти побеги отделяют от первичного экспланта и культивируют на свежей питательной среде. Активизацию пазушных меристем широко используют в промышленном размножении овощных сельскохозяйственных культур (картофель, томаты, огурцы, сахарная свекла, топинамбур и др.), цветов (гвоздика, роза, гербера), плодовых и ягодных культур (яблоня, вишня, малина, крыжовник и др.), древесных растений (туя, можжевельник и др.). Однако бесконечно размножать таким способом растения нельзя, поскольку длительное воздействие цитокининов, входящих в состав питательных сред, вызывает аномалии в морфологии стебля, потерю способности побегов к укоренению, иногда — гибель растений. В опытах с размножением земляники было показано, что при микроклональном размножении необходимо чередовать 2—3 цикла получения побегов с их укоренением.

Второй способ — индукция развития адвентивных почек, т. е. почек, возникающих из растительных клеток и тканей, которые их обычно не образуют. Этот метод в значительной мере обусловлен тотипотентностью клеток. Почти любой орган или ткань растения, свободные от инфекции, могут быть использованы в качестве экспланта и в определенных условиях образуют адвентивные почки. Данный процесс вызывают внесением в питательную среду определенных концентраций цитокининов и ауксинов, причем цитокинина должно быть гораздо больше, чем ауксина. Это наиболее распространенный способ микроразмножения высших растений. Развивая адвентивные почки на апикальных и пазушных меристемах, размножают растения томата, лука, чеснока; на сегментах листовых пластинок — салат, глоксинию, фиалки; на тканях донца луковиц — лук, чеснок, гладиолусы, тюльпаны и другие луковичные растения.

Третий способ — микрочеренкование побега, сохраняющего апикальное доминирование. Растения-регенеранты, полученные любым другим способом, можно черенковать в стерильных условиях, высаживать на свежую питательную среду, укоренять, и адаптировать к полевым условиям либо снова подвергать микрочеренкованию для того, чтобы увеличить количество посадочного материала.

Четвертый способ — размножение в биореакторах микроклубнями. Это один из способов ускоренного размножения оздоровленного материала. О. Мелик-Саркисов сконструировал гидропонную установку, позволяющую получать около 7000 микроклубней с 1 м² при массе одного клубня 5 г. Предусмотрена последующая механизированная посадка их в грунт. В отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН создана эффективная полупромышленная замкнутая система пневмоимпульсного биореактора для получения микроклубней картофеля, в которой предусмотрена возможность воздействия на направление и скорость процессов клубнеобразования. Технологии клонального микроразмножения в биореакторах разработаны не только для сельскохозяйственных, но и для декоративных растений (лилии, гладиолусы, гиацинты, филодендроны и т.д.). Однако созданные установки пока носят лабораторный, модельный характер.

Пятый способ размножения — образование соматических зародышей — основан на морфогенных изменениях — соматическом эмбриогенезе. Впервые это явление было отмечено в середине 50-х годов XX в. в культуре клеток моркови. Формирование эмбриоидов в культуре осуществляется в два этапа. На первом соматические клетки дифференцируются в эмбриональные в присутствии в питательной среде ауксинов, обычно это 2,4-D. На следующей стадии развиваются эмбриоиды. Этот процесс идет только при значительном снижении концентрации ауксина или полном отсутствии его в питательной среде. Соматический эмбриогенез может происходить в тканях первичного экспланта, в каллусной и суспензионной культурах.

Поскольку соматические зародыши представляют собой полностью сформированные растения, данный метод позволяет сократить затраты, связанные с подбором условий укоренения и адаптации растений-регенерантов. Кроме того, преимущество получения соматических эмбриоидов состоит в том, что при использовании соответствующей техники капсулирования из них можно получать искусственные семена.

Микроразмножение является весьма эффективным приемом быстрого распространения и оздоровления от инфекции новых сортов и гибридов картофеля, плодовых, ягодных, декоративных и лесных растений. Методы микроразмножения широко используются селекционерами для ускоренной репродукции ценного материала. Размножение растений in vitro может стать важным инструментом поддержания существующего биоразнообразия редких и исчезающих видов.

2. Методы генной инженерии.

Главнейшая цель генно-инженерных манипуляций применительно к селекции заключается в перенос гена, отвечающего за какой-то важный хозяйственный признак, и обеспечение его экспрессии, из одного вида в другой (трансгенез), часто очень далекий и в систематическом отношении, например, из бактерии в высшее растение. Донором гена может быть, конечно, и относительно близкий вид, когда отдаленная гибридизация невозможна из-за явной несовместимости. Трансгенез складывается из нескольких операций: - обособление переносимого гена; - клонирование его; - перенос гена в геном реципиента; - обеспечение его экспрессии; - получение растений – регенерантов с новым геном. Далее растения получают в селекционный процесс.

Успехи генной инженерии по созданию новых форм растений впечатляющие. В Мире десятки и сотни трансгенных сортов высеваются на сотнях миллионах гектарах. Препятствием к их распространению служат опасения, что они могут причинить вред при применении их в качестве кормов и продовольствия (при применении в технических целях подобных опасений нет). К сожалению, о том, кто прав: те, кто считает генетически модифицированные продукты безвредными, или те кто полагают, что можно ожидать негативных последствий от их употребления, можно будет судить лишь через большой промежуток времени и при условии больших статистических выборок. В любом случае должна присутствовать полная информация о наличии генетически изменой продукции в продуктах питания, чтобы каждый мог принимать решение об их употреблении самостоятельно. В ряде стран например в США, Канаде, генетически модифицированные продукты находят широкое применение. В России использование их запрещено, но проконтролировать использование этого закона достаточно сложно.

Достижения генетической инженерии – коммерческие сорта, которые возделываются на очень больших площадях. Однако, многие разработки так и не вышли из стадии эксперимента.

Генная инженерия наибольших успехов достигла там, где требовалось небольшое изменение генома, чтобы добиться существенного изменения хозяйственно ценного признака носящего моногенный характер.

Самое крупное достижение генной инженерии – получение трансгенных сортов, устойчивых к гербицидам. Посевы этих сортов составляют примерно 80 % от площади под всеми трансгенными сортами. Генетический механизм устойчивости к гербицидам, который удалось реализовать генно-инженерным путем, заключается либо в замене гена растения, который подвергается атаке гибрида, на ген, делающий эту атаку неэффективной, либо к введению гена, инактивирующего гербицид.

В настоящее время получены сорта и гибриды, устойчивые к гибридам у кукурузы, пшеницы, картофеля, хлопчатника, риса, сои, сахарной свеклы, томатов и других культур.

Созданы трансгенные сорта кукурузы, хлопчатника, риса, сои, картофеля, томата устойчивые к насекомым, вредителям занимающие около 400 тыс. га.

Возможно, на второе место среди достижений генной инженерии следует поставить созданные трансгенные сорта, устойчивые к насекомым вредителям. Самый известный пример введение в растения бактериального гена, ответственного за образование дельта – токсина, вызывающего гибель насекомых семейства чешуекрылых, которому принадлежит большое число опасных вредителей с.-х. культур.

Методами генной инженерии решается и проблема повышения качества продукции растениеводства. Заметные успехи достигнуты в двух направлениях: повышения качества растительного масла и повышения качества белков эндосперма зерновых культур. В первом случае получили сорта рапса с низким содержанием эруковой кислоты. Во втором – добились увеличения содержания лизина в белке кукурузы и пшеницы. Известно, что белки семян зерновых злаков неполноценны по аминокислотному составу (за исключением овса).

Ведутся работы и по повышению продуктивности растений, основанные на модификации фотосинтетического аппарата.

Повышение устойчивости к абиотическим факторам (засуха, чрезмерно высокие или низкие температуры и т.д.) методами генной инженерии чрезвычайно сложна, поскольку защитные механизмы растений полигенны. Но реакции, проявляющиеся в момент стресса, не всегда имеют столь сложную природу, и тут возможно вмешательство на уровне отдельного гена. В частности показано, что во время засухи накапливаются низкомолекулярные вещества, например пролин. Бактериальные гены, отвечающие за биосинтез пролина, были введены в растения табака.

Получены данные свидетельствующие о более высокой засухоустойчивости трансгенных растений. Ведутся и другие аналогичные исследования, но о получении стрессоустойчивости сортов методами генной инженерии говорить пока рано.

Заключение.

С конца 80-х годов прошлого века методы биотехнологии in vitro применяют для сохранения генофонда растений и используют в селекционных программах. В настоящее время считается, что на Земле существует 300 тыс. видов высших растений. В середине XX века для получения технического сырья использовалось 2062 вида, для пищевых целей – 2558, кормовых – 1567, садово- декоративных – 5741 (Куприянов, 2013). Сохранение диких сородичей для притока генов, создание коллекций сельскохозяйственных культур позволит осуществлять успешные программы по селекции растений.

Современные технологии in vitro дают возможность более эффективно организовать эту работу и позволяют: – достичь высокого уровня мультипликации растительного материала; – освободить от вирусных, бакте- риальных, грибных заболеваний; – продолжительно хранить растительный материал в асептических условиях; – экономить площади под коллекциями и затраты труда для их поддержания.

Технологии in vitro позволяют: достичь высокого уровня мультипликации растительного материала; освободить от вирусных, бактериальных, грибных заболеваний; продолжительно хранить растительный материал в асептических условиях; экономить площади под коллекциями и снижать затраты труда для их поддержания. Возможности создания банка культур in vitro для длительного хранения генофонда растений является достижением биотехнологии.

Список используемой литературы

• Бирюков В.С. Основы промышленной биотехнологии. М.: КолосС, 2004, 296 с.

• Калашникова Е.А. Клеточная инженерия растений./ Учебное пособие, РГАУ-МСХА, 2012, 318 с.

• Шевелуха В.С., Калашникова Е.А., Воронин Е.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. - Учебник. М.: Высшая школа, 2008. - 469 с

• Биотехнология : учебник для высш. пед. проф. образования / С. М. Клунова, Т.А.Егорова, Е.А.Живухина

• Т.И. Дитченко ,КУЛЬТУРА КЛЕТОК, ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ РАСТЕНИЙ КУРС ЛЕКЦИЙ http://www.bio.bsu.by

• Кузьмина Наталья Александровна, Биотехнология http://www.biotechnolog.ru

• Биофайл. Научно-информационный журнал. http://biofile.ru

• БИОТЕХНОЛОГИЯ В СЕЛЕКЦИИ, РАЗМНОЖЕНИИ И СОХРАНЕНИИ РАСТЕНИЙ ©Т.В. Плаксина, Г.Н. Пищева http://botsad.ru.

Код для цитирования: Скопировать