IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2017

Механизм биосинтеза АК представлен на рисунке 1. Под действием Δ–9–десатуразы стеариновая кислота (С₁₈) превращается в олеиновую кислоту (С_18:1). Установлено, что фермент, выделенный из Mortierella alpina 1S–4, является мембраносвязанным белком ацил–КоА–типа

Превращение олеиновой кислоты в линолевую (С_18:2) происходит при участии мембраносвязанной Δ–12–десатуразы. При участии Δ–6–десатуразы линолевая кислота превращается в γ–линоленовую кислоту (С_18:3 ω–6). Гамма–линоленовая кислота затем удлиняется до дигомо–γ–линоленовой кислоты (ДГЛК) (C_20:3 ω–6) при участии Δ–6–элонгазы. Предполагается, что именно активность Δ–6–элонгазы лимитирует скорость синтеза АК у M. alpina[1].

Как видно из рисунка, ДГЛК превращается в арахидоновую кислоту (C_20:4 ω–6) при участии Δ–5–десатуразы.

Рисунок 1- Механизм биосинтеза АК

Из вышеизложенного следует, что продукция арахидоновой кислоты и липидов в целом зависит от активности ферментов. Поэтому для моделирования данного процесса используем уравнение Михаэлиса-Ментен.

Уравнение Михаэлиса-Ментен — основное уравнение ферментативной кинетики, описывающее зависимость скорости реакции, катализируемой ферментом, от концентрации субстрата.

E+S [ES] E+P, где

E- фермент; S – субстрат;

[ES] – фермент-субстратный комплекс; Р – продукт.

Уравнение Михаэлиса-Ментен имеет вид:

(1)

R_max – максимальная скорость ферментативной реакции, при которой все молекулы фермента участвуют в образовании фермент-субстратного комплекса.

К_M – эффективная константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции достигает половины максимального значения (V=V_max/2) [2].

Исходя из определения константы Михаэлиса следует, что для эффективной работы по оптимизации процесса синтеза АК необходимо определить значение константы Михаэлиса.

В связи с вышеизложенным целью данной работы является математическое моделирование процесса синтеза липидов и АК с помощью аппроксимации полученных опытных зависимостей выхода целевых продуктов от концентрации субстрата уравнением Михаэлиса-Мэнтен.

Для получения опытных зависимостей роста M. alpina LPM-301 и синтеза АК на глицерин-содержащих субстратах (рисунок 2 и 3) исследовали в условиях периодического культивирования в 750-мл колбах. В качестве глицерин-содержащих субстратов использовали отходы производства биодизельного топлива. Исследовали следующие концентрации отходов производства биодизеля (ОПБ): 5, 10, 15 г/л. В работе использовали 2 образца глицерин-содержащих отходов: ОПБ-1, предоставленные ООО «ГанцПром», г. Сызрань; в составе образца обнаружено 83% глицерина, 9% липидов, 3% метанола и 5% солей. ОПБ-2,полученные из Греции (Pythia Institute of Biotechnology, Thessaloniki, Греция). В составе ОПБ-2 обнаружено 58% глицерина и 33,9% липидов.

Рисунок 2 - Влияние концентрации ОПБ-1 ( предоставленного ООО «ГанцПром», г. Сызрань) на синтез липидов и арахидоновой кислоты M. alpina LPM-301

Рисунок 3- Влияние концентрации ОПБ-2 (предоставленного Pythia Institute of Biotechnology, Thessaloniki, Греция ) на синтез липидов и арахидоновой кислоты M. alpina LPM-301

Для расчетов примем, что в ходе жизнедеятельности грибов произошла полная конверсия ОПБ в первый продукт в цепи образования АК – стеариновую кислоту.

Так как теоретические процессы не могут учесть большого количества изменяющихся факторов среды, реальные процессы будут несколько отклоняться от них. Поэтому для расчетов заменим теоретическую кривую, описывающую зависимость V/V_max  от S/К_M на опытную кривую, описывающую типичную реакцию ферментативного катализа, полученную путем аппроксимации данных уравнением Михаэлиса-Ментен.

Рисунок 4. Зависимость ответа сенсора от концентрации этанола с иммобилизованными клетками Gluconobacteroxydans

Зная значение опытной K_M, перестроим данных график в необходимых координатах.

Рисунок 6 – Опытная кривая зависимости V/V_max  от S/К_M

Пользуясь, опытным графиком зависимости V/V_max  от S/К_M , найдем отношение S/К_M и соответственно К_M , считая, что V/V_max =0,01* Липиды,%. Полученные данные приведены в таблице 1.

Таблица 1

Определение Км для двух ОПБ

	Концентрация ОПБ
	5 г/л	10 г/л	15 г/л
ОПБ-1
Липиды, %	12,9	14,9	15,7
V/Vmax 	0,129	0,149	0,157
S/КM	0,21	0,26	0,258
КM, г/л	23,8	38,46	58,13
КM среднее, г/л	40±19
ОПБ-2
Липиды, %	15,2	20,6	31,3
V/Vmax 	0,152	0,206	0,313
S/КM	0,256	0,380	0,619
КM , г/л	19,5	26,3	24,23
КM среднее, г/л	24±4



Полученные К_M отличаются по величине, однако имеют один порядок. Путем построения теоретических графиков V/V_max  от S/К_M с различным порядком величины К_M было показано, что в пределах одного порядка изменение значения К_M от 1 до 9 незначительно меняет вид графика. Поэтому усредняя значение К_M для разных концентраций ОПБ получим для ОПБ-1 К_M =40±19 г/л и для ОПБ-2 К_M =24±4 г/л.

Список литературы:

1. Parker-Barnes J.M., Das T., Bobik E., Leonard A.E., Thurmond J.M., Chaung L.T., Huang Y.S., Mukerjl P. Identification and characterization of an enzyme involved in the elongation of n-6 and n-3 polyunsaturated fatty acids. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 9. P. 8284-8289.

2. Варфоломеев С.Д., Березин И.В. В кн.: Физическая химия: Современные проблемы / Под ред. Я.М. Колотыркина. М.: Химия, 1982. С. 68-94

Код для цитирования: Скопировать