VIII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2016

 

Одним из основных методов диагностики лейкоза является регулярные, через каждые 30-45 дней, серологические исследования крови по РИД.

Во время производственной практики мной была взята кровь, на исследование наличия вируса лейкоза крупного рогатого скота, у 115 голов животных.

Пробы крови для исследований брали не ранее чем через 15 суток после введения животным вакцин или аллергенов, за 30 суток до отела и спустя такой же срок - после него. Серологическому исследованию на лейкоз подвергали сыворотки крови от животных в возрасте 6 месяцев (телок) и старше.

Для постановки РИД использовали диагностический набор, который состоит из специфического антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота, специфической преципитирующей сыворотки к вирусу лейкоза крупного рогатого скота, отрицательной сыворотки и других компонентов.

Кровь у крупных животных брали из подхвостовой вены. Использовали одноразовые вакуумные пробирки. От крупного рогатого скота брали 7-10 мл крови. На каждую пробирку прикрепляли этикетку с порядковым номером животного и делали соответствующую запись в журнале регистрации обработанных животных. Затем кровь в пробирках помещалась на 1-2 часа в тёплое место для свёртывания; затем в прохладное - для отстаивания. Направляли в лабораторию с нарочным. Оформляли при этом сопроводительную и опись животных.

В лаборатории лиофилизированный антиген, специфическую преципитирующую и отрицательную сыворотки растворяли дистиллированной водой в объеме, указанном на этикетке. Расплавленный агаровый гель, имеющий температуру 50—65°С, разливали слоем 2—3 мм в обезжиренные чашки Петри, установленные в горизонтальном положении, и оставляли их при комнатной температуре на 1 час.

В затвердевшем агаре с помощью штампа-пробойника прорезали лунки для тест-систем — для каждой тест-системы требуется семь лунок диаметром 5—7 мм: одна в центре и шесть по периферии, расстояние между лунками соответственно 2,5—3 мм.

Лиофилизированный антиген, контрольные и испытуемые сыворотки вносили в лунки пастеровскими пипетками, которые для каждого диагностикума были отдельные.

Антиген вносили в центральную лунку, две диаметрально противоположные лунки заполняли специфической преципитирующей сывороткой, четыре оставшиеся — испытуемыми.

После заполнения лунок чашки Петри выдерживали 48 ч при температуре 18—27°С в термостате (стеклянные пластинки — при той же температуре во влажной камере).

Реакцию учитывали через 48 ч в проходящем свете и оценивали при наличии четкой контрольной линии преципитации между антигеном и специфической преципитирующей сывороткой и отсутствии таковой с отрицательной контрольной сывороткой.

При оценке результатов реакции с испытуемыми сыворотками прежде всего устанавливали специфичность образовавшихся линий преципитации.

В зависимости от наличия специфических антител против ВЛКРС и типа получившихся линий преципитации реакцию оценивали как положительную или отрицательную.

Животное, сыворотка крови которого дала положительный результат в РИД, считали зараженным вирусом лейкоза. Его исследовали гематологическим методом исследования.

Для количественной и качественной оценки лейкоцитов брали пробу крови в пробирку с антикоагулянтом. В качестве антикоагулянта использовали трилон-Б из расчета одна капля 10%-ного раствора (на дистиллированной воде) на 1 мл крови.

Для предотвращения свертывания крови пробирку сразу же (не отходя от исследуемого животного) закрывали резиновой пробкой и тщательно перемешивали, переводя попеременно пробирку из вертикального положения в горизонтальное. Проба крови исследовалась не позднее 36 ч с момента ее взятия.

В лунки полистироловых пластин разливали по 0,4 мл жидкости Тюрка.

Стеклянным капилляром набирали предварительно перемешанную кровь до метки 0,02 мл. Марлевой салфеткой протерли наружную поверхность капилляра от крови и плавно выдували содержимое на дно пробирки с жидкостью Тюрка. Несколько раз капилляр промывали, насасывали и выдували содержимое пробирки.

Для следующего этапа работы готовили камеры Горяева, притирали к ним шлифованные стекла из комплекта камеры Горяева. В подготовленную для работы камеру Горяева при помощи глазной пипетки внесли разведенную в жидкости Тюрка пробу крови от животного. Если в камере обнаруживали пузырьки воздуха, то ее перезаряжали вновь. Выждав 1—2 мин, пока клетки осядут, их подсчитывали под микроскопом при увеличении 10x10 или 10x20. Клетки подсчитывали в 25 больших квадратах, начиная с левого верхнего угла сетки и далее сверху вниз. В каждом квадрате считали клетки, находящиеся внутри, а также лежащие на левых и нижних линиях и в левых углах квадрата.

Для подсчета содержания лейкоцитов в 1 мкл крови число подсчитанных в 25 квадратах клеток умножали на 200.

Обнаружив повышенное количество лейкоцитов провели дифференцированный подсчет лейкоцитов. Для этого приготовили мазки крови.

Для приготовления мазков крови использовали чистые обезжиренные предметные стекла без царапин и шероховатостей. Для предотвращения возможного травмирования клеток крови при производстве мазков, предметные стекла слегка подогревали (до температуры тела).

Каплю крови нанесли на правый конец стекла, не доходя на 1 см до края. Шлифованное стекло ставили впереди капли крови, надвигали до прикосновения с ней и равномерным движением влево делали мазок.

После высушивания на воздухе мазки маркировали простым карандашом, указывая номер экспертизы, инвентарный номер животного, дату приготовления мазка, и фиксировали в этиловом спирте 20-30 минут.

Окрашивали мазки в течение 20—30 минут краской Романовского — Гимза в чашках Петри. Затем краску многократно смывали дистиллированной водой и мазки высушивали на воздухе. Качество окраски контролировали под микроскопом.

Лейкоцитарную формулу выводили по результатам дифференцированного подсчета 100 клеток в окрашенных мазках крови под микроскопом с иммерсионной системой. При подсчете предметное стекло продвигали по зигзагообразной линии в направлении к концу мазка.

Таким образом, одним из основных методов диагностики лейкоза является серологические исследования крови по РИД. Благодаря данным исследованиям мы периодически делаем выводы о возникновении или распространении вируса лейкоза крупного рогатого скота среди животных.

При гематологическом исследование был получен один положительный результат. Животное было отправлено на убой в мясокомбинат, остальное поголовье повторно исследовано в РИД и получен отрицательный результат.

Код для цитирования: Скопировать