VIII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2016

Оглавление

Введение 3

Слюна. Состав слюны 4

Методы клинического анализа слюны 6

• Анализ слюны для экспертизы ДНК на основе ПРЦ. 6

• Определение гормонов в слюне методом иммуноферментного анализа 7

• Биомаркеры слюны для диагностики инфекционных заболеваний 8

• Масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой 9

Микроэлементное содержание биологической жидкости. 11

Экспериментальная часть. 14

• Методика исследования. 15

• Результаты и их обсуждение 16

Заключение 20

Список литературы 22

Введение

До недавнего времени использование слюны в диагностических целях было затруднено. Существует несколько причин этого: во-первых, низкий уровень определения, во-вторых, сложность обнаружения, в –третьих, не всегда получаемые показатели коррелируют с таковыми в плазме крови, и в- четвертых, отсутствует точная методика сбора и хранения проб данного материала до проведения анализа. На сегодняшний день эти проблемы в большей мере устранены в результате тщательного изучения секреции и физиологии слюнных желез, а так же методологии забора и обработки образцов слюны.

Слюна легко собирается и хранится, а так же идеально подходит для диагностики. Возрастает интерес к использованию слюны и других образцов из полости рта для диагностики системных заболеваний и заболеваний полости рта. Это очень важно для ряда популяций, для обследования детей и престарелых. Так же очень выгоден такой объект анализа при ограниченном доступе медицинской помощи в удаленных географических районах, где забор крови невозможен.

Целью данной работы являлось использование атомно-эмиссионного анализатора КИР-Майя для определения щелочных и щелочноземельных металлов в малых объемах проб сложного фазового состава(ротовая жидкость), созданного Яговым В.В., Коротковым А.С. и Погониным В.И. в лаборатории Химических сенсоров ГЕОХИ РАН под руководством Б.К.Зуева

Слюна. Состав слюны

Слюна – сложный по составу биологический материал. На количество и состав слюны влияют различные факторы: обще состояние организма, функциональная активность слюнных желез, вязкость слюны, консистентный состав употребляемой пищи, наличие пищевых остатков, гигиеническое состояние полости рта.

За сутки выделяется от 0,5 до 2,2 л слюны, рН слюны варьируется от 5,5 до 8,0. Так же слюна выполняет важные функции, такие как: пищеварительную, минерализующую, защитную, регуляторную и буферную.[1]

На 98,5 % слюна состоит из воды, содержит соли различных кислот, микроэлементы и катионы щелочных металлов, ферменты и некоторые витамины. Белки - основное органическое вещество слюны, которое синтезируется в слюнных железах.

Основные белки: альбумины, глобулины, муцин, иммуноглобулины, ферменты [2]

Химический состав слюны подвержен суточным колебаниям, он также зависит от возраста (у пожилых людей, например, значительно повышается количество кальция, что имеет значение для образования зубного и слюнного камня). Изменения в составе слюны могут быть связаны с приемом лекарственных веществ и интоксикациями. Уменьшение слюноотделения и изменения в составе слюны приводят к нарушениям пищеварения, заболеваниям зубов.[3]

Слюна как основной источник поступления в эмаль зуба кальция, фосфора и других минеральных элементов влияет на ее физические и химические свойства, в т.ч. на резистентность к кариесу. [4]

Методы клинического анализа слюны

В настоящий момент существуют различные анализы где главным объектов исследования является слюна.

• Анализ слюны для экспертизы ДНК на основе ПРЦ.

В данном анализе берут мазок полости рта, при исследовании которого можно получить дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) образца. Это используется в судебно-медицинских исследованиях. [5]

С подробными результатами анализа слюны для экспертизы ДНК можно ознакомиться в работе Aki.K., Izumi A. и Hosoi E. [6]

• Определение гормонов в слюне методом иммуноферментного анализа

В массовых исследованиях наиболее распространено определение кортизола в слюне. Кортизол - стероидный гормон, который синтезируется в пучковой зоне коры надпочечников.

Определение свободного биологически активного кортизола в слюне производится методом иммуноферментного анализа.[7]

С подробными результатами определения картизола в слюне можно ознакомиться в работе Gerritsen L,. Geeerlings M.I.,Beekman A.I. [8]

• Биомаркеры слюны для диагностики инфекционных заболеваний

Часто молекулы, полученные из слюны используются в качестве диагностических биомаркеров заболеваний полости рта, вызванные грибками ( Candida), вирусами папилломы человека (ВПЧ),вирус Эпштейна – Барр (ВЭБ), а так же бактериями (некоторые из них участвуют в заболеваниях пародонта и кариеса).

Наличие распространенного заболевания полости рта ,вызванного ВПЧ, такого как вирус простого герпеса 1 и 2 типа, вирус ветряной оспы, вирус герпеса человека, говорят нам о иммунодефиците у человека (ВИЧ).

Благодаря существованию биомаркеров слюны при сборе анализа крови возможно свести к минимуму заражение ВИЧ.

Экспериментально обнаружен ВПЧ в образцах слюны с помощью ПЦР и ознакомиться с полученными результатами можно в работе Adamopoulou M., VAiraktaris E., Panis V.[9]

Используя мммуноферментный метод в стоматологии определяют биомаркеры заболеваний полости рта инфекционно-воспалительной природы. В частности, при заболеваниях периодонта методом ИФА определяют содержание таких биомаркеров, как цитокины, протеогликаны, пептидные продукты тканевой деструкции. Этот принцип используется в стоматологии и в качестве экспресс-метода диагностирования ВИЧ-инфекции с использованием проб из десневого содержимого [10].

• Масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой

Все вышеописанные методы не позволяют определить содержание в биологическом образце отдельных элементов, что порой так необходимо при анализе. Одним из таких методов является масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой. В работе Рувинской Г.Р. [11] Результаты исследования приведены в таблице 1.

Таблица 1. Концентрация химических элементов в ротовой жидкости

Элемент	Концентрация в ротовой жидкости (n=48), мг/дм3
натрий	180,20+12,90
кальций	95,3+6,0
магний	11,5+1,46
калий	1435+62,8

Существует так же методика дугового атомно-эмиссионного спектрального анализа жидких биопроб.

В работе Савинова С.С.[12 ] рассмотрен принцип данного анализа и заключается он в следующем: на торец подготовленного (обожженного и с нанесенной защитной пленкой) нижнего угольного электрода наносится с помощью микрошприца жидкая проба в виде капли объемом 10 мкл, которая высушивается под инфракрасной лампой. Далее наносится капля водного раствора NaCl – спектрального буфера, которая так же высушивается. Затем электрод в паре с верхним (заточенным на конус) электродом устанавливается в штативе камеры дугового разряда (рис. 1)

Рис. 1. Блок-схема спектральной установки

Принцип действия источника заключается в преобразовании электрической энергии в импульсы разрядного тока, возбуждающие между электродами аналитического промежутка низкотемпературную плазму.

В анализе последовательно наносилось 15 капель (каждая объемом 10 мкл) слюны, которые выпаривались под ИК-лампой. После определения концентраций элементов по указанному выше способу полученные данные были подвергнуты статистическому анализу. Данные представлены в табл. 2

Табл. 2. Содержание элементов в слюне [12]

Электролит	Найдено ,мМ
Na+	19,78
Mg2+	0,92
Ca2+	6,00

Для нас особый интерес при анализе биологической пробы представляют 4 электролита, обоснование этого представлено ниже.

Микроэлементное содержание биологической жидкости.

Основные катионы организма — натрий, калий, кальций, магний. Анионы — хлор, гидрокарбонат, фосфаты, сульфат. Концентрацию электролитов в Международной системе единиц (СИ) выражают в ммоль/л. Имеются значительные различия в количественном распределении электролитов между внутри- и внеклеточной жидкостями. Во внеклеточной жидкости представлены в основном ионы натрия, хлора, гидрокарбоната. Во внутриклеточной жидкости — более высокие концентрации ионов калия, магния, фосфатов и сульфата. Электролиты выполняют в организме следующие функции: отвечают за осмолярность жидкостей тела, образуют биоэлектрический потенциал, катализируют процессы обмена веществ, определяют рН жидкостей тела, стабилизируют костную ткань, служат в качестве «энергетического депо» и участвуют в свертывании крови

Экспериментальная часть.

Аппаратура. На рис. 2 приведена блок-схема прибора созданного Яговым В.В., Коротковым А.С. и Погониным В.И. в лаборатории Химических сенсоров ГЕОХИ РАН под руководством Б.К.Зуева. Источником эмиссионных спектров является электрический разряд между верхним мениском капли пробы (1) и нижним мениском жидкой линзы (2). Пробу в виде капли наносят пипет-дозатором (3) на торец толстостенной фторопластовой трубки (4), в которую плотно вставлен катод в виде проволоки из нержавеющей стали диаметром 1,5 мм. Катод соединен с отрицательным полюсом высоковольтного источника питания ВС-22. Раствор, образующий жидкую линзу, поступает из верхней части ячейки (5) со скоростью 1 капля/ 35-40 сек, падение каждой капли сопровождается замыканием цепи и электрическим разрядом вызывающим распыление, атомизацию и возбуждение компонентов анализируемого раствора. Торец кварцевого световода (6) никогда не остается сухим, поскольку жидкость постоянно подается через кольцевой зазор между корпусом световодного жгута и внешней стеклянной трубкой.

Для возбуждения капельно-искрового разряда электроды соединены с источником постоянного тока, конденсатором (2,2 кВ, 3 мкФ) через балластное сопротивление 1 кОм. Времяразрешенный сигнал – силу тока, напряжение и интенсивность света – регистрировали с помощью платы ввода-вывода L154 (L-Card, Россия). Для регистрации излучения, возникающего в момент разряда, использовали оптическую систему, состоящую из кварцевого световода (светопропускание в области 180-900 нм), монохроматора МДР-3 с дифракционными решетками 600 и 1200 штрихов на мм (спектральная ширина 0,1-0,5 нм) и фотоприемного модуля Н8249 (Hamamatsu,, Япония). Общее управление прибором и математическую обработку результатов выполняет разработанная авторами программаpackage.exe, работающая в среде Windows.

Рис. 2. Схема микроплазменного анализатора. 1 — капля пробы, 2 — жидкая линза, 3 — пипетка, 4 — фторопластовая трубка с металлическим катодом, 5 — система подачи кислоты, 6 — световод

Растворители и реагенты. Использовали дистиллированную воду , кальций ( 1 мг/мл ГСО), магний (1 мг/мл ГСО), калий (1 мг/мл), натрий ( 1 мг/мл ГСО) и хлороводородную кислоту, ОС.Ч. («Химмед», Россия).

Растворы готовили непосредственно перед проведением эксперимента. Аликвотные части отбирали при помощи набора микропипеток ThermoScience (диапазоны объемов 1–20, 20–200, 100–1000 и 1000–10000 мкл, точность отбора аликвотной части ±1.5%). Для измерения массы использованы весы Extended ED Sartorius AG, Германия.

Методика исследования.

Подготовка пробы к анализу.

В пробирку из полиэтилентерефталата вносили 1 г ротовой жидкости, добавляли 50 мкл хлороводородной кислоты и интенсивно встряхивали 1 мин, после чего отстаивали не менее 15 мин. Затем аликвотную часть отбирали пипет-дозатором и разбавляли хлороводородной кислотой 3:100 в 20 раз.

Методика определения элементов

Верхнюю часть ячейки (5) заполняли 0,3М HCl, устанавливали скорость падения 1капля/35-40 с. За время между разрядами с торца фторопластовой трубки (4) удаляли жидкость, оставшуюся от предыдущего измерения, а затем наносилипипет-дозатором пробу объемом 25 мкл в виде «купола» (1). Аналитическим сигналом служила интегральная интенсивность свечения на соответствующей длине волны за первые 20 мс разряда. Металлы определяли по наиболее интенсивным атомным линиям:Na — 589,0 нм, K — 766,5 нм , Ca — 422,7 нм, Mg — 518 нм.

Определение содержания элементов осуществляли методом добавок, добиваясь по возможности равенства исходного и добавочного сигналов. Для определения предела обнаружения использован 3σ-критерий, а для расчета диапазона определяемых содержаний —критерий s_r

Код для цитирования: Скопировать