VII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2015

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

EEA1 (early endosome antigen 1) – антиген ранних эндосом 1;

EGF-R (epidermal growth factor receptor) – рецептор эпидермального фактора роста;

ITK – Image ToolKit

PDE (partial differential equation) – уравнение в частных производных

GAC – Geodesic Active Contours

Thresholding – пороговая сегментация

LBF model (local binary fitting) – модель локального бинарного приближения;

IR model (intensity re-weighting) – модель повторного взвешивания интенсивности;

нм – нанометры.

ВВЕДЕНИЕ

Одним из основных процессов взаимодействия органелл клетки является везикулярный транспорт, который обеспечивает поглощение веществ и перенос биологических комплексов внутри клетки [1]. В 2013 г. важность изучения данного процесса была подтверждена присуждением Нобелевской премии по физиологии и медицине Рэнди Шекману, Джеймсу Ротману и Томасу Зюдхофу за раскрытие механизмов везикулярного транспорта.

Эндоцитоз позволяет клеткам поглощать вещества, путем втягивания (инвагинации) участка клеточной мембраны и образования в цитоплазме мембранного пузырька -эндосомы, являющейся одним из видов транспортных везикул. Большинство эндосом, образующихся в результате эндоцитоза из плазматической мембраны, транспортируются внутрь клетки, где сливаются с существующими эндосомами, образуя, таким образом, эндосомную сеть. С помощью эндоцитоза клетка утилизирует отработанные поверхностные рецепторы, импортирует необходимые макромолекулы, а также захватывает бактерии, вирусы и другие чужеродные агенты в процессе иммунной защиты [2].

Компьютерный анализ изображений рецептор-опосредованного эндоцитоза эпидермального фактора роста в клетках HеLa, полученных на конфокальном микроскопе, необходим, чтобы количественно охарактеризовать динамическое поведение сети эндосом в клетке. Сегментация изображений – важная составляющая медицинских приложений по диагностике и анализу данных, использующаяся для выделения объектов и границ (линии, кривые, и т. д.) на изображениях.

Цель работы - применение и исследование метода сегментации Geodesic Active Contours для получения количественных характеристик движения эндосом из экспериментальных временных серий изображений.

В ходе работы необходимо решить следующие задачи:

- применить имеющуюся процедуру анализа изображений для нового набора данных;

- изучить параметры, необходимые для использования метода Geodesic Active Contours;

- провести сегментацию предобработанных изображений, с помощью имеющейся процедуры и сравнить результаты.

ОБЗОР МЕТОДОВ СЕГМЕНТАЦИИ

Сегментация изображений – важная составляющая медицинских приложений по диагностике и анализу данных, использующаяся для выделения объектов и границ (линии, кривые, и т. д.) на изображениях. Существует несколько основных методов сегментации: эвристические методы, методы на графах, кластеризация, энергетические методы [3].

К эвристическим методам относятся: разрастание регионов (Region growing), разделения и слияния регионов (Split & Merge), водораздел (Watershed). В методе разрастания регионов заложена простая идея - начиная с некоторой точки необходимо обходить пиксели и объединять их в области, пока выполняется условие однородности. Идея метода разрастания и слияния регионов заключается в том, что сначала проводится разбиение изображения на небольшие однородные области, а затем слияние между собой тех из них, которые вместе не нарушают требование однородности. Процедура продолжается до тех пор, пока остаются регионы, которые можно объединить. В методе водораздела предлагается рассматривать изображение как некоторую карту местности, где значения яркостей представляют собой значения высот относительно некоторого уровня. Если эту местность заполнять водой, тогда образуются бассейны. При дальнейшем заполнении водой, эти бассейны объединяются. Места объединения этих бассейнов отмечаются как линии водораздела. Данный метод достаточно чувствителен к шуму, поэтому может потребоваться постобработка изображений.

Методы теории графов – одно из наиболее активно развивающихся направлений в сегментации изображений. Общая идея методов этой группы следующая. Изображение представляется в виде взвешенного графа, с вершинами в точках изображения. Вес ребра графа отражает сходство точек в некотором смысле (расстояние между точками по некоторой метрике). Разбиение изображения моделируется разрезами графа. Обычно в методах теории графов вводится функционал «стоимости» разреза, отражающий качество полученной сегментации. Так задача разбиения изображения на однородные области сводится к оптимизационной задаче поиска разреза минимальной стоимости на графе. Такой подход позволяет помимо однородности цвета и текстуры сегментов управлять также формой сегментов, их размером, сложностью границ и т. п.

Задачу сегментации можно свести к задаче кластеризации. Для этого достаточно задать отображение точек изображения в некоторое пространство признаков и ввести метрику (меру близости) на этом пространстве признаков. В качестве признаков точки изображения можно использовать представление ее цвета в некотором цветовом пространстве, примером метрики (меры близости) может быть евклидово расстояние между векторами в пространстве признаков. Тогда результатом кластеризации будет квантование цвета для изображения. Задав отображение в пространство признаков, можно воспользоваться любыми методами кластерного анализа. Наиболее популярные методы кластеризации, используемые для сегментации изображений – к-средних [4] (обобщенный метод Ллойда), EM алгоритм [5]. Основная проблема методов кластеризации, состоит в том, что пространственное расположение точек либо не учитывается совсем, либо учитывается косвенно (например, используя координаты точки как один из признаков). Поэтому обычно после кластеризации точек изображения проводят процедуру выделения связных компонент. Методы кластеризации плохо работают на зашумленных изображениях: часто теряют отдельные точек регионов, образуется много мелких регионов, и. т. п.

Методы сегментации, применяющие принцип минимизации некоторого функционала, обычно называются энергетическим по своему содержательному смыслу. Данные методы используются в тех случаях, когда есть возможность получить начальное предсказание, где проходит контур; сегменты имеют относительно простую форму; есть возможность получить вводную информацию о пользователя. Таким образом, задача сегментации сводится к построению функции энергии контура и ее оптимизации. К таким методам, например, относятся: Snakes, ТурбоПиксели (TurboPixels), Методы уровня (Level Sets – LBF model, IR model [6]). IR model – один из последних разработанных методов сегментации изображений, который является расширением LBF модели. Данный метод позволяет избежать попадания в локальные минимумы и имеет более высокую скорость сходимости по сравнению с LBF model.

ОПИСАНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МЕТОДА

Сравнительно недавно, новые геометрические модели активных контуров были одновременно предложены Касселом и Маллади [6]. Эти модели основаны на теории эволюции кривой и геометрических потоков, которая в последнее время привлекает все большее количество ученых, занимающихся сегментацией изображений. В этих моделях активных контуров, кривая распространяется (деформируется) со средней скоростью, которая содержит два параметра: один связан с гладкостью кривой, а другой с её сжатием и расширением относительно границы.

Методика основана на активных контурах, изменяющихся во времени в соответствии с присущими геометрическими мерами изображения. Развивающиеся контуры разделяются и сливаются, позволяя одновременно обнаруживать несколько объектов и обе границы (внутреннюю и внешнюю). Данный подход основан на связи между активными контурами и вычислением геодезических или минимальных кривых расстояния. Минимальная кривая расстояния лежит в римановом пространстве, метрика которого определяется содержанием изображения. Это означает, что обнаружение границы может быть эквивалентно нахождению кривой минимальной взвешенной длины. Эта интерпретация дает новый подход для нахождения границ с помощью активных контуров, основанных на геодезических или минимальных вычислений расстояния. Далее вычисление геодезической кривой сводится к геометрическому потоку, который похож на тот, который получен в процессе эволюции кривой в упомянутых выше подходах. Однако, этот геодезический поток содержит новый компонент в скорости кривой, основанный на информации изображения, который улучшает эти модели. Новый компонент скорости позволяет точно отслеживать границы с высокой изменчивостью их градиента, в том числе с малыми пропусками, что является трудноосуществимой задачей в рамках предыдущих подходов. Этот геодезический подход для сегментации объектов позволяет соединить классический метод Snakes, основанный на минимизации энергии и геометрические активные контуры, основанные на основе теории эволюции кривой.

Модель задается с помощью геометрического потока (PDE):

,

где u – функция расстояния;

g(I) – функция остановки;

с – константа скорости.

Данный подход имеет следующие основные свойства:

1. Описывает связь между энергией и эволюцией кривой в методах активных контуров.

2. Представляет активные контуры для обнаружения объектов как геодезический вычислительный подход.

3. Улучшает существующие модели развития кривой с помощью геодезической формулировки.

4. Позволяет одновременно обнаруживать внутренние и внешние границы в нескольких объектах без специальных процедур отслеживания контуров.

5. Содержит формальные результаты существования, единственности, стабильности и согласованности.

6. Не требует особых условий остановки.

ОПИСАНИЕ ИСХОДНЫХ ДАННЫХ, ИСПОЛЬЗУЕМОГО ПО И ИМЕЮЩЕЙСЯ ПРОЦЕДУРЫ ОБРАБОТКИ ИЗОБРАЖЕНИЙ

В работе использованы данные (изображения) рецептор-опосредованного эндоцитоза эпидермального фактора роста в клетках HеLa, полученные на конфокальном микроскопе Leica TCS SP5 с использованием флуоресцирующих антител. Исследуемые изображения представляют собой 24-битовые изображения в формате TIFF. Тестовый набор изображений содержит данные для временных точек 01, 15, 60 и 90 минут. Для каждого момента времени получены 2 изображения: в первом канале - EEA1 (зеленая флуоресценция), во втором канале - EGF-R (красная флуоресценция).

Построение сценариев для сегментации эндосом было осуществлено с помощью ПО ProStack. Данное ПО предназначено для обработки и анализа изображений в области системной биологии и медицины. В пакете ProStack сценарии обработки строятся с помощью создания диаграмм в визуальном редакторе, который не требует навыков программирования. Пакет ProStack успешно применяется для получения количественной информации из экспериментальных изображений биологических объектов [7].

Для реализации следующего этапа работы, который заключался в обработке того же набора тестовых изображений с помощью метода сегментации Geodesic Active Contours, была выбрана библиотека ITK [8].

Для сегментации объектов данный метод использует следующие фильтры:

- itk::GeodesicActiveContourLevelSetImageFilter;

- itk::CurvatureAnisotropicDiffusionImageFilter;

- itk::GradientMagnitudeRecursiveGaussianImageFilter;

- itk::SigmoidImageFilter;

- itk::FastMarchingImageFilter, itk::BinaryThresholdImageFilter.

На рис. 1 изображены основные компоненты, которые включены в задачу сегментации объектов с помощью метода Geodesic Active Contours:

Рис. 1. Основные компоненты метода сегментации Geodesic Active Contours

Конвейерная обработка начинается с первой стадии сглаживания, используя itk::CurvatureAnisotropicDiffusionImageFilter. Сглаженное изображение поступает на вход itk::GradientMagnitudeRecursiveGaussianImageFilter и затем в itk::SigmoidImageFilter , чтобы получить потенциальные изображения границ. Набор начальных точек, которые определяются пользователем, поступает на вход itk::FastMarchingImageFilter, чтобы вычислить карту расстояний. Постоянная величина извлекается из карты расстояний, чтобы получить множество уровней, в котором нулевое множество представляет инициирующий контур. Данное множество уровней является входным параметром для GeodesicActiveContourLevelSetImageFilter. В конечном итоге множество уровней, сгенерированное GeodesicActiveContourLevelSetImageFilter поступает в itk::BinaryThresholdImageFilter для создания бинарной маски, представляющей собой сегментированные объекты.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Основные шаги процедуры сегментации эндосом во временных сериях изображений в ПО ProStack: загрузка изображений в двух каналах (зеленый -EEA1 и красный -EGF-R), применение фильтров (удаление шумов, выравнивание интенсивности, выделение границ объектов –пороговая сегментация, разделение «слипшихся» объектов и т.д.), получение маски, получение контрольных изображений объектов и их количественных характеристик. Время, требуемое для обработки всех 50-ти изображений составляет 1 час 19 минут, количество шагов равно 93 . Процедура применена к тестовому набору изображений. Качество сегментации оценивалось визуально с помощью наложения изображения границ объектов на экспериментальное изображение. В результате для всех выделенных объектов получены количественные характеристики, такие как площадь, ширина, высота, средняя интенсивность и т.д.

Пространственно-временная динамика эндосом проанализирована с помощью исследования зависимости количества объектов определённого вида от заданного размера в заданный момент времени. Гистограмма зависимости представлена на рис.2:

Рис.2. Зависимость количества объектов от заданного размера в моменты времени 1, 15, 60 и 90 минут

По горизонтальной оси –диаметр объектов в нанометрах, по вертикальной –количество объектов в клетке. Для построения гистограммы выбран шаг изменения диаметра объекта в 200 нм. Анализируя полученные гистограммы можно сделать следующие выводы: в первые минуты после начала эндоцитоза в клетке преобладают достаточно малые объекты диаметром от 200 до 400 нм; к концу эндоцитоза количество объектов уменьшается, а их размеры увеличиваются; максимальное количество объектов в клетке наблюдается на 60-ой минуте эндоцитоза, минимальное -на 90-ой минуте. Полученные количественные результаты соответствуют известным характеристикам, таким как среднее число объектов в клетке, размер, коэффициент кластеризации. Однако зависимость количества объектов от заданного размера в момент времени 1 минута не совсем верна, так как в этот момент в клетке должны преобладать объекты с меньшим диаметром. Полученная неточность в результатах может быть исправлена за счет использования дополнительных фильтров и более точных методов сегментации.

Для использования метода Geodesic Active Contours, необходимо, чтобы пользователем были заданы следующие параметры:

Input Image (Имя входного изображения)	Output Image (Имя выходного изображения)	Seed Index (Начальные точки )	Distance (Значение дистанции)	σ Сигма	α Альфа	β Бетта	Propagation Scale (Величина распространения)
		X, Y	6	0,01	-0,01	0,4	250

Все параметры были подобраны экспериментальным путем. В ходе экспериментов было установлено:

- координаты начальных точек необходимо задавать как можно точнее в соответствии с расположением объектов на исходном изображении;

- Distance отвечает за дистанцию, на которую может «развиться» контур и если его значение >6, то сегментируется только часть объектов, а остальные теряются;

- σ, α, β, Propagation Scale не влияют на расширение контура, от них зависит количество обнаруженных объектов. Большие значения σ увеличивают риск «утечки» контура при его развитии. α и β могут быть как положительными, так и отрицательными. Чем меньше значения σ, α, β, тем результаты сегментирования лучше. Значения параметра Propagation Scale превышающие значение 250, не влияют на результат.

На рисунке 3 представлены результаты сегментирования нескольких изображений (по одному для каждого момента времени в канале EEA1) из тестового набора данных с помощью процедуры в ПО ProStack и с помощью метода Geodesic Active Contours:

	ПО ProStack	Geodesic Active Contours
Момент времени	EEA1	EEA1
15 минут
60 минут
90 минут

Рис. 3. Сравнение сегментированных изображений с помощью процедуры в ПО ProStack и с помощью метода Geodesic Active Contours

На рисунке 4 представлены гистограммы, иллюстрирующие сравнение двух методов сегментации с помощью зависимости количества объектов в каждый момент времени для канала EGFR.

Рис. 4. Зависимость количества объектов в каждый момент времени (сверху вниз: 15 минут, 60 минут, 90 минут) для канала EGFR

По горизонтальной оси – количество изображений в данный момент времени, по вертикальной – количество объектов в клетке. Анализируя гистограмму можно сделать вывод, что в каждый момент времени с помощью метода Geodesic Active Contours обнаруживается больше объектов, чем с использованием существующей процедуры в ПО ProStack. Но данные результаты пока не позволяют сделать вывод о том, что все объекты, сегментированные с помощью исследуемого метода – истинные объекты. Так как среди них могут оказаться и артефакты, то есть ложные объекты (шум, тень и т.д.). Поэтому следует продолжить исследование данного метода.

ВЫВОДЫ

В ходе работы была применена имеющаяся процедура анализа изображений в ПО ProStack для нового набора данных. Получены гистограммы, отражающие пространственно-временную динамику эндосом с помощью исследования зависимости количества объектов определённого вида от заданного размера в заданный момент времени. Полученные количественные результаты соответствуют известным характеристикам, таким как среднее число объектов в клетке, размер, коэффициент кластеризации. Однако зависимость количества объектов от заданного размера в момент времени 1 минута не совсем верна, так как в этот момент в клетке должны преобладать объекты с меньшим диаметром. Полученная неточность в результатах может быть объяснена использованием в данной процедуре одного из самых простых методов сегментации –пороговой. Поэтому на следующем этапе была проведена сегментация изображений с помощью метода GeodesicActive Contours, являющегося на сегодняшний день одним из самых точных методов сегментации. Но несмотря на то, что с помощью данного метода выделилось более количество объектов, нельзя утверждать, что это истинные объекты, так как среди них могут быть и ложные (шум, тень и т.д.), следовательно, требуется продолжать исследовать и дорабатывать данный метод.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Дальнейшая работа будет направлена на улучшение результатов сегментации эндосом во временных сериях изображений рецептор-опосредованного эндоцитоза (повышение эффективности и точности), путем применения дополнительных фильтров и доработки метода GeodesicActive Contours.

Данные результаты будут использованы для разработки теории объяснения механизмов, лежащих в основе коллективного поведения многих индивидуальных эндосом.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. James E. Rothman, The machinery and principles of vesicle transport in the cell, NATURE MEDICINE, VOLUME 8, NUMBER 10, OCTOBER 2002, 1059-1062.

2. Marianna V. Kharchenko, Alexander A. Aksyonov, Maria M. Melikova, Elena S. Kornilova, Epidermal growth factor (EGF) receptor endocytosis is accompanied by reorganization of microtubule system in HeLa cells, Cell Biology International 31 (2007) 349-359.

3. Р. Гонсалес, Р. Вудс, Цифровая обработка изображений, Москва, ТЕХНОСФЕРА, 2005.

4. Bishop, C. M., Neural Networks for Pattern Recognition. Oxford, England: Oxford University Press, 1995.

5. L. Lucchese and S.K. Mitra “Color Image Segmentation: A State-of-the-Art Survey”, 2001.

6. VICENT CASELLES, RON KIMMEL, GUILLERMO SAPIRO, Geodesic Active Contours, International Journal of Computer Vision 22(1), 61–79, 1997.

7. Козлов К.Н., Писарев А.С., Самсонова М.Г. (2011). Разработка сценариев обработки биомедицинских изображений в пакете ProStack. Сборник статей второй международной научно-практической конференции “Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине”, 26-28.10.2011, Санкт-Петербург, Россия, под редакцией А.П. Кудинова, Б.В.Крылова, Издательство Политехнического университета, с. 207-209.

8. Will Schroeder, Josh Cates, The ITK Software Guide, 2005.

Код для цитирования: Скопировать