VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014

Промышленно-стерильными считают консервы, содержащие жизнеспособные клетки негазообразующих непатогенных и нетоксигенных аэробных бацилл вида Васillus subtilis. В промышленно-стерильных консервах не должно содержаться патогенных и токсигенных микроорганизмов, а также возбудителей порчи консервов: термофильных бацилл, газообразующих мезофильных бацилл. Допустимое количество клеток микроорганизмов в 1 г консервируемого продукта, не нарушающее его микробиологической стабильности в процессе хранения и не представляющее опасности для здоровья человека, составляет 1:10¹ - 1:10³ [3,6,7].

При порче пищевых продуктов происходит ферментативный распад белковых и липидных компонентов с образованием вредных соединений. Поэтому использование в пищевой и консервной промышленности некоторых добавок, например агара и желатина, способствует в ряде случаев порче ряда кулинарных изделий и продуктов [3,5].

Возможность фагоидентификации вытекает из специфичности действия фагов, которая может быть настолько выражена, что позволяет дифференцировать не только отдельные виды, но и серологически неотличимые штаммы в пределах одного вида [1]. Поэтому все большее число исследователей предпочитают обращаться к фаговым тестам, как единственному средству, способному дифференцировать близкородственные штаммы [2,4].

Материалы и методы. В исследованиях использовали фаги BacillussubtilisBs-13, Bs-16; объекты исследований (водопроводную воду, комбикорм, мясо, пряности) контаминировали штаммами бактерий Bacillussubtilis(Bacillussubtilis 6633, Bacillussubtilis 2) в концентрации 10⁵, 10⁴, 10³, 10², 10¹ м.к./мл., полученными из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина».

Используя строгую родовую и видовую специфичность селекционированных бактериофагов, нами была разработана схема выделения и ускоренной идентификации бактерий Bacillussubtilis. Подготовку и посев проб кормов и пищевых продуктов, подлежащих исследованию, проводили в соответствии ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб» [8] и ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов» [9].

Для искусственной контаминации пробы воды (мяса, комбикорма и пряностей) объемом (весом) 10 мл (г) вносили в стерильные колбы объемом 100 мл, заливали стерильным МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 мл (г) исследуемой пробы. В колбы вносили индикаторные культуры в концентрации 10⁵, 10⁴, 10³, 10², 10¹ м.к./мл (г). Полученные смеси встряхивали в шуттель-аппарате в течение 15 минут и ставили в термостат на 24 часа при 37°С. Затем надосадочную жидкость исследовали в соответствии со схемой, представленной на рис.2.Первоначально производили посев по МПА по методу Дригальского для выделения чистой культуры Bacillussubtilis, а затем производили посевы на среду Гаузе № 2 и среду Громыко. Инкубировали посевы в условиях термостата в течение 24 часов в условиях термостата при 37°С. Затем выросшие колонии пересевали на МПБ и инкубировали в условиях термостата в течение 18 часов в условиях термостата при 37°С. Следующим этапом наших исследований было изучение биологических свойств выделенных культур по тестам, отраженным на рис.1. Результаты исследований представлены в таблицах 1 и 2.

В основу приведенной ниже схемы оценки диагностических признаков выделенных бацилл положены принципы, изложенные в работах R. Gordon [10] автора систематики рода Bacillusв последних изданиях определителя бактерий Bergey [11].

Бульонные культуры, полученные после пересева колоний с вышеперечисленных сред на МПБ, микроскопии (окраска по Граму) и при наличии в мазках грамположительных палочек с закругленными концами, располагающихся одиночно и попарно, подвергали фагоидентификации.

На поверхность МПА в чашках Петри пастеровской пипеткой наносили 3-4 капли бульонной 18-часовой культуры исследуемых микроорганизмов. Нанесённую культуру равномерно распределяли по поверхности среды стерильным шпателем. Чашки ставили в термостат для подсушивания на 15-20 минут.

Чашку делили бактериологическим карандашом на три сектора. На поверхность засеянной среды, в зоне первого сектора, пастеровской пипеткой легким прикосновением капли наносили фаг Bs-13 УГСХА, на второй сектор аналогично наносили фаг Bs-16 УГСХА, на третий сектор в качестве контроля наносили стерильный МПБ. Наклоняли чашку, чтобы капли стекли в виде дорожки. Чашки оставляли для подсушивания в боксе на 15-20 минут и помещали в термостат на 18 часов при 37°С. По аналогичной методике изучали работу цереусных бактериофагов Вс -4 и Вс-8 серии УГСХА.

Результат исследований считали положительным, если на месте нанесения фагов на газоне сплошного роста культуры образовывалась прозрачная зона лизиса с вторичным ростом фагорезистентных микроорганизмов или без него, а также рост негативных колоний фага. Отрицательным считали результат - отсутствие лизиса на газоне роста исследуемой культуры микроорганизмов и отсутствие лизиса в контроле. При положительном результате культуру относили к виду Bacillussubtilis. Результаты опытов представлены в таблице 3.

Рис.1. Схема выделения и дифференциации бактерий Bacillussubtilis

Таблица 1 - Результаты исследований объектов санитарного надзора на наличие бактерий Bacillussubtilisна среде Гаузе № 2

Объекты		Количество микробных клеток в 1 гр (мл), проба №1				Количество микробных клеток в 1 гр (мл), проба №2				Количество микробных клеток в 1 гр (мл), проба №3
		101	102	103	104	101	102	103	104	101	102	103	104
1	вода	-	-	-	+	-	-	-	+	-	-	-	+
2	пряности	-	-	-	+	-	-	-	+	-	-	-	+
3	мясо	-	-	-	+	-	-	-	+	-	-	-	+
4	комбикорм	-	-	-	+	-	-	-	+	-	-	-	+

Примечание:

"+" - положительный результат,

"-" - отрицательный результат.

Таблица 2 - Результаты исследований объектов санитарного надзора на наличие бактерий Bacillussubtilisна среде Громыко

Объекты		Количество микробных клеток в 1 гр (мл), проба №1				Количество микробных клеток в 1 гр (мл), проба №2				Количество микробных клеток в 1 гр (мл), проба №3
		101	102	103	104	101	102	103	104	101	102	103	104
1	вода	-	-	-	+	-	-	-	+	-	-	-	+
2	пряности	-	-	-	+	-	-	-	+	-	-	-	+
3	мясо	-	-	-	+	-	-	-	+	-	-	-	+
4	комбикорм	-	-	-	+	-	-	-	+	-	-	-	+

Примечание:

"+" - положительный результат,

"-" - отрицательный результат.

Таблица 3 -Фагоидентификация бактерий Bacillussubtilisбактериофагами Bs-13 и Bs-16 серии УГСХА

	Объекты	Результат воздействия фагов Bs-13 и Bs-16 серии УГСХА
		Проба 1	Проба 2	Проба 3
1	вода	+	+	+
2	мясо	+	+	+
3	пряности	+	+	+
4	комбикорм	+	+	+

Примечание:

"+" - положительный результат,

"-" - отрицательный результат.

Заключение.Фагоидентификация бактерий Bacillussubtilisбактериофагами Bs-13 и Bs-16 серии УГСХА дала положительные результаты: из всех исскуственно контаминированных бактериями Bacillussubtilisпроб пряностей, комбикорма, водопроводной воды и мяса были выделены культуры, которые при взаимодействии с вышеуказанными фагами были лизированы ими. При получении отрицательных результатов фагоидентификации необходимо проведение детального изучения ферментативных, серологических и патогенных свойств выделенных микроорганизмов. На рисунке 2 изображена схема фагоидентификации бактерий Bacillussubtilis. Она представлена в сравнении с традиционной схемой выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы [7], изложенной в «Определителе бактерий Берджи» [10]. Доказано, что время исследований в соответствии с разработанной нами схемой короче на 71 час с меньшими затратами посуды и реактивов

Рис. 2. Схема ускоренной идентификации бактерий вида Bacillussubtilis с помощью селекционированных нами бактериофагов (I)в сравнении со схемой выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы, изложенной в «Определителе бактерий Берджи».

Библиографический список

1. Адамс, М. Бактериофаги / М. Адамс. – М., Медгиз, 1961. – С. 26-121.

2. Габрилович, И.М. Общая характеристика бактериофагов / И.М. Габрилович // Основы бактериофагии. – Минск, 1973. – С.5 – 24.

3. Калдыркаев, А.И. Модификация методики выделения фагов бактерий вида Bacilluscereus / А.И.Калдыркаев, Д.А. Васильев, Н.А. Феоктистова // Актуальные проблемы инфекционной патологии в ветеринарной медицине: материалы II-й конференции молодых ученых. – Покров: ВНИИВВиМ, 2012. − С.112–117.

4. Каттер, Э. Бактериофаги. Биология и практическое применение / Э. Каттер, А. Сулаквелидзе. − М.: Научный мир, 2012. − С. 365-369.

5. Клевакин, В. М. Санитарная микробиология пищевых продуктов / В.М. Клевакин, В.В. Карцев. – Л.: Медицина, 1986. – С. 164.

6. Мустафин, А.Х. Методика выделения Bacillussubtilis/ А.Х.Мустафин, Н.А. Феоктистова // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: материалы международной научно-практической конференции посвященной 65-летию УГСХА. − Ульяновск: УГСХА, 2008. − Ч.IV. − С.100–104.

7. Смирнов, В.В. Спорообразующие аэробные бактерии - продуценты биологически активных веществ / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.А. Василевская. - Киев: Hayкова Думка, 1982. - С. 117-120.

8. ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб».

9. ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов».

10. Bergey’s manual of determinative bacteriology, Williams and Wilkins Co, Baltimore, Md., 8th ed., 1974. - 1246 p. 191.

11. Gordon, R.The genus Bacillus / R. Gordon //In: Handb. Microbiol. Cleveland (Ohio). - 1973. - V.l. - P.71-88.

Код для цитирования: Скопировать