V Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2013

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК – комплиментарная ДНК

РНК – рибонуклеиновая кислота

ДГПЖ – доброкачественная гиперплазия предстательной железы

РПЖ – рак предстательной железы

ПЦР – полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ – ПЦР в реальном времени

об/мин – оборотов в минуту

bp – пар нуклеотидов

BPH – доброкачественная простатическая гипертрофия = ДГПЖ

CpG (CGI) – цитозин-гуаниновые динуклеотиды (цитозин-гуаниновые островки)

Dnmts – ДНК-метилтрансфераза

dNTP – дезоксинуклеотидтрифосфат

GRN-A – гранулин-А

GSTP 1 (glutathione S-transferase) – глутатион S-трансфераза 1

PIN – неспецифическая неоплазия предстательной железы

PSA (prostate-specific antigen) – простатспецифический антиген

PSCA (Prostate Stem Cell Antigen) – антиген стволовых клеток простаты

PSMA (prostate-specific membrane antigen) – специфичный для простаты мембранный антиген

Taq-полимераза – термостабильная полимераза

TERT (telomerase reverse transcriptase) – теломераза обратная транскриптазе

ВВЕДЕНИЕ

Рак предстательной железы (РПЖ) - одно из трех наиболее распространенных раковых новообразований (более 30% от всех случаев), диагностируемых у мужского населения. К счастью, относительно небольшая часть мужчин (1 из 8) имеющих это заболевание, умирает от РПЖ. Тем не менее, в группу с высоким риском проявления рака простаты входят все лица мужского пола в возрасте старше 65 лет (Jemal и др., 2005).

До настоящего времени не обнаружены маркеры, которые могли бы дифференцировать острую клиническую фазу РПЖ от клинически мягкого течения этой болезни. Такие диагностические возможности чрезвычайно актуальны, так как согласно статистике в течение пяти лет после диагностирования локального РПЖ выживает 88% пациентов, тогда как доля выживших пациентов с диагностированной болезнью на метастазирующей стадии составляет только 29%. Определение РПЖ на ранней стадии также существенно повышает уровень выживания пациентов после радикальной простатэктомии (Coffey, 1993). Поэтому необходимы более чувствительные и «превентивные» маркеры наличия рака простаты и начала его прогрессии. Это поможет избежать ненужного лечения, предсказывать течение болезни и применять более эффективную терапию. Многочисленные работы в этой области выявили разнообразные потенциальные маркеры РПЖ в сыворотке крови, моче, семенной жидкости и гистологических образцах. На сегодняшний день особенно актуальным является изучение влияния эпигенетических изменений на развитие раковых заболеваний.

Рак является многоэтапным процессом мутаций в ключевых регуляторных генах и эпигенетических изменений, приводящих к утрате сбалансированной экспрессии генов. Изменения в статусе метилирования ДНК, известные как эпигенетические изменения, являются одним из наиболее распространенных молекулярных изменений в человеческой неоплазии, в том числе и при раке простаты (Epstein и др., 1993; Lengauer и др., 1998).

Эпигенетические изменения - это изменения в проявлении генов, не обусловленные изменением генетической информации (мутациями). Эпигенетические изменения происходят в результате модификации уровня экспрессии генов, то есть их транскрипции и/или трансляции. Наиболее изученным видом эпигенетической регуляции является изменение экспрессии паттерна генов, вызванное, в частности, метилированием ДНК с помощью белков ДНК-метилтрансфераз. Это приводит к временной, зависящей от условий жизни организма инактивации (снижением экспрессии или полным выключением) метилированного гена (http://translate.google.ru).

Основной целью данной работы является отработка методов выделения ДНК и РНК и последующая амплификация для дальнейшего анализа эпигенетических изменений.

В рамках поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучение литературы по вопросу влияния эпигенетических изменений на развитие рака предстательной железы.

2. Знакомство и отработка методик, с помощью которых исследуется генная экспрессия и влияние метилирования на уровень экспрессии ряда генов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Экспрессия генов и генетические маркеры при развитии РПЖ

Рак простаты - гетерогенная болезнь, со сложной этиологией, включающей в себя и генетические аномалии, и хорошо доказанные влияния экологических факторов, и взаимодействие между этими двумя факторами.

Рак предстательной железы проявляется в выраженной изменчивости на генетическом и гистологическом уровнях, а также в своем клиническом проявлении и развитии. Известно, что одной из причин рака является накопление множественных соматических изменений в экспрессии и/или в первичных нуклеотидных последовательностях онкогенов (в самих онкогенах и генах-супрессорах опухолей), которые часто сами являются элементами сигнальных путей роста клетки (Brothman, 1992).

Стремительное увеличение зарегистрированных случаев РПЖ привело к лавине исследований, большая часть которых пытается найти корреляцию различных геномных и белковых маркеров с наличием рака простаты, прогрессией этой болезни или выздоровлением пациентов. Некоторые из этих маркеров были также предложены для терапевтических целей при лечении РПЖ. Однако до настоящего времени, ни один из потенциальных маркеров не был утвержден для клинического использования (Sharief, 1992).

PSA (prostate-specific antigen) - калликреин-подобная сериновая протеаза 3 типа.

Альтернативные названия: kallikrein-related peptidase 3 - KLK3; kallikrein 3; antigen prostate-specific – APS.

В 1980 г. PSA был обнаружен в сыворотке крови больных раком простаты, и впоследствии было установлено критическое содержание PSA в сыворотке крови мужчин на уровне 4 нг/мл. Уровень в сыворотке выше 4 нг/мл служил первым сигналом для дальнейшей клинической оценки возможного наличия карциномы простаты (Riegman, 1979). Однако другие исследования подвергли сомнению чувствительность и специфичность PSA - теста (Lilleby, 2001). Проблема состоит в том, что сывороточные уровни PSA могут быть повышены в результате наличия не только рака простаты, но и доброкачественной (мягкой) простатической гипертрофии (ВРН) и простатитов. В итоге ложноположительные результаты - существенная проблема для теста PSA - могут привести к ненужным болезненным биопсиям. Не меньшее беспокойство представляет и то, что у 20-30% мужчин с РПЖ сыворотка крови содержит уровни PSA в нормальном диапазоне, приводя к недиагностированной болезни (ложноотрицательные результаты).

Несмотря на эти недостатки, PSA в настоящее время - лучший клинический маркер, доступный для диагностики рака простаты, и единственный маркер РПЖ, одобренный Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США и Минздравсоцразвития РФ (Christiansen, 2003).

На сегодняшний день рассматривается применение в клинических исследованиях других перспективных маркеров: гранулин-А (GRN-A); глутатион S-трансфераза 1 (GSTP1); антиген стволовых клеток простаты (PSCA); специфичный для простаты мембранный антиген (PSMA); и теломеразу TERT.

GRN-A (гранулин-А).

Альтернативные названия: progranulin - PGRN; epithelin precursor proepithelin - PEPI; acrogranin.

Было выяснено, что сверхэкспрессия гена програнулина приводит к приобретению монослойной культурой клеток способности образовывать клоны в полутвердом агаре, и к увеличению количества регистрируемых митозов. Уменьшение экспрессии гена програнулина подавляло рост этих клеток. Авторы предположили, что уровень роста некоторых культур эпителиальных клеток пропорционален уровню экспрессии, свойственной гену GRN-A, и что увеличенная экспрессия гена програнулина вызывает трансформацию фенотипа эпителиальных клеток, включая способность к опухолевому росту (Berruti, 2001).

Необходимо учитывать, что количественные показатели уровня GRN-A в сыворотке крови не позволяют точно отличить ВРН от рака простаты, но они хорошо коррелируют со стадией опухоли и её видом. Кроме того, этот маркер специфичен для нейроэндокринных клеток и, таким образом, потенциально может использоваться для идентификации андроген-независимого РПЖ.

Два существенных недостатка GRN-A как маркера – не 100%-ое присутствие нейроэндокринных клеток в опухолях простаты и, как следствие, невозможность выявить в большинстве случаев раннюю стадию болезни. Однако исследования подтверждают, что с помощью GRN-A можно контролировать успех лечения, предсказать результат болезни и дать прогноз при лечении андроген-независимого РПЖ. При комплексном подходе, GRN-A - хороший кандидат для дальнейшего клинического использования в качестве маркера РПЖ (Isshiki, 2002).

GSTP 1 (glutathione S-transferase) - глутатион S-трансфераза 1.

Альтернативные названия: glutathione S-transferase 3 - GST3; GST, class PI; fatty acid ethyl ester synthase III.

Биологический смысл выбора GSTP1 для идентификации РПЖ - его важная роль в предотвращении повреждений клеточных структур путем нейтрализации свободных радикалов. Этот маркер обладает уникальными свойствами для выявления важных эпигенетических феноменов в силу легкости метода его детекции, основанного на метилировании. Исследования экспрессии GSTP1 показали её уменьшение при развитии РПЖ, в основном являющееся следствием гиперметилирования промотора этого гена, что представляет собой самое распространенное эпигенетическое изменение, связанное с этой болезнью. Также было выявлено, что в клетках рака простаты метилирование генаGSTP1 не ограничивается одним только промотором, но встречается повсюду, где есть CpG островки (Jeronimo, 2002). В нескольких исследованиях была обнаружена высокая чувствительность исследований метилирования гена GSTP1 при идентификации неспецифической неоплазии предстательной железы (PIN) и РПЖ, а также способность дифференцировать их от ВРН. Снижение экспрессии гена GSTP1 после гиперметелирования области промотора было обнаружено в 80-95% случаях карциномы простаты, в 70% PIN и 6% ВРН (Lin и др., 2001; Jeronimo и др., 2002). Это свидетельствует о том, что изменение активности гена GSTP1 - раннее событие в онкогенезе простаты.

Положительные стороны использования GSTP1 в качестве клинического маркера РПЖ - возможность количественной оценки статуса метилирования генаGSTP1 в тканях и в клетках, полученных из сыворотки, мочи и семенной жидкости, а также его высокая распространенность при этом заболевании (Ahlegren и др., 2000).

PSCA (Prostate Stem Cell Antigen).

Антиген стволовых клеток простаты (PSCA) - это специфичный для поверхности клеток простаты белок, экспрессия которого была обнаружена исключительно в моделях опухоли ксенотрансплантата LAPC-4 РПЖ человека.

Исследования PSCA с помощью различных методов, показали, что повышенная экспрессия PSCA обнаруживается в 48-94% случаев РПЖ.

В то время как биологическая роль PSCA при возникновении РПЖ неясна, тем не менее, этот орган-специфичный маркер имеет хороший потенциал для терапевтических целей. Анти-PSCA моноклональные антитела прекращали рост опухоли и формирование метастаз человеческих ксенотрансплантатов, выращенных в scid-мышах (Gu и др., 2000). Это открывает перспективы для терапии раковых образований простаты человека с использованием иммунологических методов. Кроме того, экспрессия PSCA проявляет сходные тенденции положительной корреляции с экспрессией c-myc онкогена и степенью прогрессии опухоли в локальных раковых образованиях простаты высокой стадии развития (Ross и др., 2002).

Основные недостатки результатов исследований PSCA как маркера РПЖ - небольшое количество опубликованных работ, подтверждающих его ценность в роли клинического маркера, недостаточная точность количественных оценок, и отсутствие информации о независимости маркера PSCA от содержания PSA. Учитывая доступность данных и ценность для терапевтических целей, необходима дальнейшая оценка PSCA (Rhodes и др., 2003).

PSMA (prostate-specific membrane antigen) - специфичный для простаты мембранный антиген.

Альтернативные названия: prostate-specific mеmbrane antigen - PSM, glutamate carboxypeptidase II - GCP2; FOLH; N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase 1 - NAALAD1; N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase 1 - NAALADase I.

PSMA – мембранный белок клеточной поверхности (Prostate-Specific Membrane Antigen) и один из наиболее экстенсивно изученных маркеров РПЖ. PSMA - интегрированный в мембраны белок II типа, который проявляет множественные ферментативные свойства.

В настоящее время точная биологическая роль PSMA в развитии РПЖ неясна. Однако существуют обширные данные об его информативности в качестве маркера онкологической трансформации предстательной железы, более чувствительного и специфичного чем PSA. Высокий уровень экспрессии гена PSMA проявляется более чем у 90% больных РПЖ как в случаях первичного рака простаты, так и при метастазировании. PSMA можно обнаружить с использованием антител в тканях опухоли и в сыворотке крови; методами IHC и Western - анализа в тканях простаты; методами ПЦР-РВ – транскрипции и ELISA в сыворотке крови (Liguo Zhang и др., 2007). Недавние технологические достижения придали исследованиям по определению этого маркера в человеческой сыворотке высокую пропускную способность, благодаря использованию белковых чипов и методов масс-спектрометрии (Isshiki и др., 2002).

Слабость PSMA в качестве клинического маркера заключается в повышенных уровнях белка в сыворотке крови, обнаруживаемых и у здоровых мужчин, и у здоровых женщин, и у больных раком молочной железы, а также у испытуемых старше 50 лет. Однако есть множество данных, подтверждающих способность PSMA идентифицировать РПЖ на ранних стадиях. Развитие новых технологий позволяет проводить количественный анализ PSMA с высокой пропускной способностью в различных биологических жидкостях. Эти факты свидетельствует в пользу дальнейшей разработки и валидации маркера, чтобы определить, действительно ли PSMA имеет клиническую ценность для детекции рака простаты, или как объект лечения данного заболевания (Brothman и др., 2002).

TERT (telomerase reverse transcriptase) – теломераза обратная транскриптазе.

Альтернативные названия: telomerase catalytic subunit (TCS1); EST2.

ГенTERT кодирует обратную транскриптазу - компонент теломеразы, которая поддерживает теломерные концы хромосом и связан со старением и развитием рака [88].

Многие клетки человека прогрессивно теряют терминальные последовательности хромосом с каждым делением клетки, и эта редукция коррелирует с очевидным отсутствием теломеразной активности в этих клетках. Высокая активность TERT возможна при возникновении клеточного бессмертия, являющегося главным шагом в процессе онкогенного преобразования, что объясняет факт отсутствия TERT также и в большинстве доброкачественных опухолей. Таким образом, определение этого маркера может быть очень чувствительным методом для обнаружения метастазирующих раковых клеток. Было проведено большое количество исследований для оценки TERT или теломеразной активности в раковых образованиях простаты (Meid и др., 2001). Опубликованные отчеты демонстрируют, что повышенные уровни активности TERT проявляются в 63-94% случаев рака простаты. В большинстве исследований отмечали отсутствие маркера в нормальных тканях простаты и в большинстве тканей ВРН. Самая высокая активность TERT коррелирует с плохо дифференцированной стадией болезни, и есть доказательства корреляции активности TERT со стадией опухоли, её видом, неблагоприятным прогнозом и рецидивом болезни. Активность TERT не связана с уровнем PSA, что делает её потенциально независимым маркером при диагностике РПЖ (Straub и др., 2001).

TERT также имеет и несколько минусов, как клинический маркер для идентификации РПЖ. Во-первых, теломеразная активность не простат-специфична, и, во-вторых, в большинстве исследований, эксперименты проводились на тканях простаты, а это требует биопсийного материала для исследования этого маркера (весьма болезненная процедура) (Chieco и др., 2001).

Таким образом, клиническая применимость TERT ещё не полностью раскрыта, несмотря на независимость активности TERT от показателя PSA, высокую ценность применения TERT для ранней детекции РПЖ, определения стадии заболевания или прогноза. Дальнейшая оценка TERT может выявить более точное использование этого маркера в качестве приложения к PSA-тесту.

1.2. Эпигенетическая регуляция генов путем метилирования. Понятие о метилировани ДНК

Одним из важнейших факторов, влияющих на экспрессию генов, является их метилирование.

Метилированные основания в ДНК обнаружены свыше 50 лет назад. ДНК прокариот содержит модифицированные основания N6-метиладенин и 5-метилцитозин, тогда как ДНК высших эукариот - в основном 5-метилцитозин. Метилирование остатков цитозина ДНК имеет место у бактерий, растений, животных, в том числе млекопитающих (включая человека), но отсутствует у дрожжей, нематод и дрозофилы. Метилирование осуществляется ферментативно в первые минуты после репликации ДНК, т.е. пострепликативно. Поскольку нуклеотидная последовательность ДНК при этом не меняется, метилирование по сути своей - событие эпигенетическое. Оно, хотя и является стабильной и наследуемой модификацией, в принципе обратимо под воздействием деметилирующих агентов или ферментов и тем самым принципиально отличается от мутаций ДНК. В общебиологическом плане феномен метилирования является элементом системы распознавания "свой-чужой" (Maruyama и др., 2002).

Благодаря существующей в бактериях системе метилирования-рекогниции (рестрикции-модификации) клетки способны идентифицировать свой генетический материал и отличать его от инородных молекул, проникших в клетку тем или иным способом. Уничтожение последних позволяет поддерживать генетическую стабильность вида. Иногда один фермент имеет две - метилазную и эндонуклазную - активности, в большинстве случаев определённый сайт ДНК распознается двумя ферментами, один из которых метилирует его, а другой расщепляет. В целом система функционирует таким образом, что метилазы "метят" специфические последовательности собственной ДНК, а чувствительные к метилированию рестрикционные эндонуклеазы узнают и расщепляют те из последовательностей, которые соответствующей метки не имеют. Так, бактериальная клетка защищает себя от вторжения чужеродных молекул. Например, ДНК проникшего в бактериальную клетку фага расщепляется в определённых сайтах специфическими эндонуклеазами, в то время как те же последовательности в собственной ДНК защищены от расщепления, поскольку метилированы. Роль метилирования ДНК как компонента клеточной "иммунной системы", предназначенной для уничтожения чужой или излишней ДНК (или подавления ее функций), сохраняется, по-видимому, на протяжении эволюции, но конкретные механизмы реализации этой задачи могут быть существенно иными. Например, клетки Neurospora элиминируют нежелательные повторяющиеся последовательности посредством интенсивного их метилирования, за которым следует накопление точковых мутаций из-за высокой мутабельности остатков 5-метилцитозина. Подобным же образом в клетках грызунов и человека интегрированные вирусные последовательности могут подвергаться метилированию и обусловленному им стабильному блоку транскрипции (Bestor и др., 1996).

В широком эволюционном плане переходы от прокариот к эукариотам и от беспозвоночных к позвоночным сопровождались, по-видимому, резким увеличением числа генов. Эти драматические изменения вызвали к жизни, видимо, и новые способы ограничения нежелательной активности "лишних" генов - формирование ядерной мембраны и нуклеосомную организацию хроматина в первом случае, функциональную переориентацию системы метилирования - во втором. Если у беспозвоночных она сводилась к подавлению активности потенциально опасных последовательностей ДНК (таких как вирусы и транспозоны), то у позвоночных ее назначение - еще и стабильная репрессия эндогенных генов (гены инактивированной хромосомы X, импринтированные гены, часть тканеспецифичных генов) (Yoder и др., 1997).

Профиль метилирования, сильно влияющий на функциональное состояние гена, стабильно передается в ряду клеточных поколений. С этой точки зрения, для организмов с большой продолжительностью жизни и интенсивной тканевой регенерацией (позвоночные, растения) надежная система эпигенетической наследственности (типа метилирования ДНК) жизненно необходима. В противоположность этому у маленьких животных и животных с малой продолжительностью жизни, т.е. в ситуациях, когда значительное новообразование клеток отсутствует, такой необходимости нет. Предполагают, что именно этим обстоятельством объясняется отсутствие системы метилирования ДНК у нематод и дрозофилы (Jablonka и др., 1998).

У млекопитающих метилирование ДНК служит цели стабильного функционального подавления части генетического материала ( silencing ). У млекопитающих на протяжении всей жизни животного функционирует относительно малая доля генома (~5%), тогда как большую его часть составляет генетический балласт. Последний подвергается интенсивному метилированию (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17485372).

Активация метилирования, кроме того, отмечена при различных процессах, приводящих к появлению новой ДНК: трансфекция ДНК, разного рода дупликации инициируют процесс модификации появившихся копий. Особой стимулирующей активностью в этом отношении обладают инвертированные повторы. Таким образом, повторяющиеся последовательности, с одной стороны, и присутствие 5-метил-цитозина, с другой, - характерные и взаимосвязанные признаки эукариотических геномов (http://www.medscape.com/viewarticle/703576).

Одни повторы, накапливавшиеся в геноме человека на протяжении эволюции, по-видимому, функционально бесполезны, другие (транспозоны) потенциально опасны. Естественно поэтому, что они сильно метилированы и, как следствие, неактивны, их транскрипция чревата для клетки метаболическим хаосом.

Метилированные участки "ущемлены" и в другом отношении - они позже, чем активные последовательности, реплицируются в фазе S клеточного цикла. Что касается конкретного механизма блока транскрипции, индуцированного метилированием, то он опосредован изменением структуры хроматина.

Установлено, что в основе эпигенетической «маркировки» отдельных участков генома и явления геномного импринтинга в частности лежат специфические структурно-молекулярные изменения отдельных участков хромосом, происходящие во время формирования мужских и женских половых клеток, которые приводят к стойким функциональным различиям экспрессии гомологичных генов у потомства. Основную роль в этом процессе отводят специфическому для особей разного пола метилированию цитозиновых оснований в CpG-динуклеотидах ДНК, которое устанавливается во время гаметогенеза и выключает транскрипцию генов. Специфические для родителей эпигенетические отпечатки, подавляющие транскрипцию генов, стираются в примордиальных половых клетках плода и вновь устанавливаются в зрелых половых клетках потомка в соответствии с его полом, обеспечивая дифференциальную экспрессию отцовских или материнских генов в следующем поколении (Maruyama и др., 2002).

Тканеспецифичное метилирование цитозиновых остатков ДНК у млекопитающих осуществляется с помощью 4 ДНК-метилтрансфераз (Dnmts) - Dnmtl, Dnmt2, Dnmt3A и Dnmt3B. Dnmtl поддерживает специфический рисунок метилирования в митотически размножающихся клетках. После репликации две полуметилированные дочерние молекулы ДНК распознаются этим ферментом и конвертируются в полностью метилированные. Установлено, что клональные популяции гистологически однородных клеток могут не иметь однородный характер метилирования, и поэтому не исключено, что неточность соматической эпигенетической маркировки отдельных генетически идентичных клеток может лежать в основе их фенотипического разнообразия и, возможно, достаточно ярко выраженной внутривидовой морфофизиологической вариабельности. Более того, существует предположение, что нарушение эпигенетической регуляции генов может определять развитие комплексных (мультифакториальных) заболеваний, причем именно эта причина лучше объясняет особенности их возникновения, чем вариации в последовательностях ДНК, включая однонуклеотидные замены оснований. Поддержка нужного статуса метилирования генома является непременным условием нормального развития у мышей, а аберрантное метилирование связано с возникновением опухолей и аномалий развития у человека (http://translate.google.ru).

.

1.3. Метилирование ДНК в раковых клетках простаты

Эпигенетические события ведут к изменению хроматина и вызывают изменения экспрессии генов. Метилирование остатков цитозина в CpG островках является одним из основных эпигенетических случаев подавления экспрессии генов. В опухолях нормальное функционирование эпигенетической-регулятивной системы нарушено, что ведет к неуместному гиперметилированию CpG островков и нарушению экспрессии батареи генов, вовлеченных в критические клеточные процессы.Все шире признается в течение последних 4-5 лет, что CGI ( CpG ) большого числа генов, которые в основном неметилированны в нормальной ткани, метилированны в различной степени в человеческих раковых клетках, поэтому опухоли характеризуются конкретными изменениями. Было выявлено присутствие аномально высокой концентрации ДНК в сыворотке крови, плазме и моче больных с различными злокачественными заболеваниями (Jablonka и др., 1998).

При раке простаты эпигенетические механизмы имеют важное значение для развития и прогрессирования заболевания, дополняя, усиливая и диверсифицируя его генетическими изменениями. Гиперметилирование некоторых генов происходит главным образом в начале канцерогенеза, и может быть использовано для обнаружения рака, тогда как гипометилирование и дальнейшие события гиперметилирования связаны уже с прогрессией заболевания. Изменения метилирования ДНК взаимодействуют с изменениями белков хроматина.Заметные изменения на этом уровне включают в себя изменения паттернов модификаций гистонов, а также изменения транскрипции корепрессоров и коактиваторов. Такие изменения относятся к важным изменениям в сети транскрипционных факторов. Эта сеть контролирует дифференцировку и пролиферацию эпителиальных клеток простаты, путем интеграции сигналов от гормонов, факторов роста и белков клеточной адгезии, которые тоже изменены в случае рака простаты. Как следствие, клетки карциномы простаты приобретают аберрантное состояние, характеризующееся непрерывной пролиферацией больших дифференцированных клеток. Аберрантный статус дифференцировки в клетках карциномы простаты приводит также к искажению взаимодействий между эпителиальными и стромальными клетками опухоли, что способствуют росту опухоли, инвазии и метастазированию (Dawson и др., 1998).

Раковые образования сопровождаются драматическими изменениями в клеточном профиле метилирования, такие глобальные деметилирования генома происходит параллельно с CGI гиперметилированием конкретных генов, что сильно связано с их транскрипционной инактивацией. Несколько из этих генов, в том числе RAR-b 2, INK4a, RASSF1a и APC, проявляют функции супрессоров опухолей, инактивация которых связана с гиперметилированием CGI, происходящая при развитии рака простаты.

Гиперметилирование несоответствующего гена, катализируемое ДНК метилтрансферазами (Dnmts), может представлять собой раннее событие в развитии рака, возможно, связанное со старением.

Метилирование гена рецептора эстрогена (ESR1), активность которого после этого снижается, как предполагается играет определенную роль в метастазировании раковых опухолей, также зафиксировано при раке предстательной железы. Гипометилирование определенных генов также связано с развитиием рака простаты. Например, Ван и др. сообщили о гипометилировании генов WNT5A, CRIP1 и S100P в раковых, но не в нормальных тканях предстательной железы (Zheng и др., 2004).

В последние годы все большее число исследований сообщало о наличии метилированных ДНК в биологических жидкостях при различных видах злокачественных новообразований, включая мочу больных раком предстательной железы при установлении диагноза и отсутствии метилирования ДНК у здоровых людей в контрольной группе. Изменение метилирования ДНК является особенно чувствительным и поддается обнаружению. В отличие от этого, для выявления генетических мутаций, необходимо решить проблему большого числа возможных мутаций (Yoder и др., 1997).

Различия в структуре метилирования используются также в качестве маркеров. Например, различия между нормальной и опухолевой клеткой могут быть использованы для обнаружения присутствия опухолевых клеток в биоптатах или выявления опухоли по полученным ДНК в образцах крови. Различия в паттернах метилирования различных опухолей может быть связано с индивидуальными свойствами образцов (пациентов) или другими клиническими процедурами, и могут быть использованы в качестве маркеров для классификации опухолей .

Анализы на метилирование являются удобными для исследования, поскольку в них могут использовать такие чувствительные методы, как метилирование-ПЦР, и таким образом использовать небольшое количество образцов. Благодаря своей относительной простоте, безопасности и чувствительности, метил-специфичная ПЦР чаще всего используется для анализа метилирования (Liguo Zhang и др., 2007).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Практическая часть работы выполнена в период 2009-2010 гг на базе Южного Научного Центра Российской Академии Наук, Объединенного Отдела Аридных зон в лаборатории молекулярной биологии под руководством ст.н.с, к.б.н. Водолажского Д.И. и н.с., к.б.н. Тимошкиной Н.Н.

Мною освоены методики: выделение ДНК методом «на стекле» из цельной крови и препаратов плазмы крови, проведение экстракции ДНК и РНК из переферической крови фенол-хлороформным методом, очистка препаратов РНК от ДНК (с помощью ДНКазы I; экзонуклеазы S1; экзонуклеазы Lambda и осаждения РНК с помощью хлорида лития), синтез кДНК на базе матрицы РНК, проведение бисульфитной модификации проб ДНК, проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ПЦР в реальном времени, проведение электрофореза ДНК в агарозном геле.

Материалом служили пробы периферической крови и плазмы крови доноров с диагностированным РПЖ, ДГПЖ и условно здоровых мужчин.

2.1. Выделение ДНК «на стекле» (ООО Медиген) из цельной крови и препаратов плазмы крови

К 100 мкл образца (плазма крови) в пробирке на 1,5 мл добавляли 300 мкл раствора I и 10 мкл суспензии сорбента. Смесь тщательно перемешивали на вортексе и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре, перемешивая на вортексе через каждые 3 минуты.

Пробы центрифугировали 60 секунд на микроцентрифуге при 5000 об/мин. Супернатант отобрали.

К осадку добавляли 150 мкл раствора II и перемешивали на вортексе. Сорбент осаждали центрифугированием 60 секунд при 5000 об/мин. Супернатант отобрали.

К осадку добавляли 0,7 мл раствора III и перемешивали на вортексе. Сорбент осаждали центрифугированием 60 секунд при 5000 об/мин. Супернатант отобрали.

Пробы подсушивали в твердотельном термостате 5 минут при 50 °С. В пробирки добавляли 50 мкл стерильной воды. Пробирки закрыли, содержимое перемешали на вортексе и инкубировали в термостате 5 мин при 50 °С. Пробы центрифугировали 60 секунд при 12000 об/мин.

Водную фазу, содержащую ДНК, использовали для последующих ферментативных манипуляций (ПЦР).

2.2. Проведение экстракции ДНК из переферической крови фенол-хлороформным методом

100 мл пробы крови смешивали с равным объемом смеси фенол-хлороформ в 1,5 мл пробирке с пластмассовой крышкой. После этого размешивали содержимое пробирки так, чтобы образовалась эмульсия. Центрифугировали 3 минуты при 1600 об/мин в центрифуге Эппендорф.

Верхний водный слой переносили пипеткой в новую пробирку, промежуточную и нижнюю органическую фазы отбросили. Повторили очистку фенол-хлороформной смесью.

ДНК осаждали, добавив 2 объема охлажденного 96%-ого этанола, и снова размешивали. Для лучшего формирования осадка ДНК, экспонировали пробу при -20 °С в течение 1 часа.

Центрифугировали при +4 °С и 12000 об/мин в течение 20мин. Промывали пробу дважды охлажденным 70%-ым этанолом. Осадок ДНК подсушивали при +40 °С в течение 10-15 мин.

Осадок ДНК растворяли в 50-150 мкл деионизированной воды.

2.3. Выделение РНК из лейкоцитов периферической крови согласно стандартному протоколу фенол-хлороформной экстракции

Предварительно подготовили следующие реагенты:

Гемолизирующий буфер: 0,84% NH4Cl;

STE-буфер: 10mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 1mM EDTA;

2M Na ацетат, pH=4,5;

Лизирующий буфер для РНК: 4М гуанидинтиоционат, 25 мМ цитрат натрия (рН=7,5), 0,5% саркозил, 0,1М 2-меркаптоэтанол.

К 2-3мл крови в 10мл-пробирке приливали гемолизирующий буфер. Смешивали перевертыванием и инкубировали в холодильнике при +4°С в течение 20-30 минут.

Пробирку центрифугировали при 1500 об/мин в течение 20 минут. Супернатант сливали, оставив осадок белых клеток.

Ресуспендировали осадок клеток в 1-1,5 мл STE-буфера и переносили в пробирку эппендорф. Центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант сливали.

К осадку добавляли лизирующий раствор для РНК (объём в зависимости от размеров осадка 0,5-1мл).

Тщательно ресуспендировали осадок с помощью 2мл шприца до тех пор, пока раствор не перестал быть вязким. Объём измеряли пипеткой. Добавили 1 объём фенола для РНК, ½ объема хлороформа и ¼ объема 2М ацетата натрия для РНК. Хорошо встряхнули.

Смесь инкубировали 10 мин. при комнатной температуре. Центрифугировали в течение 10 мин. при 12000 об/мин.

Аккуратно переносили верхнюю водную фазу с РНК в новую 1,5мл пробирку, стараясь не захватить интерфазу, содержащую ДНК. Повторили экстракцию фенол-хлороформ-ацетатной смесью.

К отобранной в чистую пробирку верхней фазе добавили 1 объём изопропанола (или 2,5 объёма этанола), хорошо перемешали. Инкубировали при -20 ⁰С в течение 1 часа. Центрифугировали при 12000 об/мин в течение 15 мин. Супернатант аккуратно отобрали пипеткой.

К осадку РНК добавили 300-500 мкл 80% этанола. Встряхнули на вортексе, промывая осадок и центрифугировали при 12000 об/мин 5-10 мин. Супернатант аккуратно отобрали и заново повторили эту процедуру.

Осадок РНК подсувашили от остатков спирта, затем растворяли в DEPC-воде так, чтобы раствор РНК можно было легко набирать пипеткой.

2.4. Очистка препаратов РНК от ДНК

1. Протокол для приготовления РНК, свободной от ДНК, с помощью ДНКазы I

В пробирке собирали mix-смесь из расчёта на 1 реакцию: РНК (1 mg), 10Х реакционный буфер с MgCl2 (1 mkl), DEPC-H2O (до 9 mkl), DNase 1, RNase-free (1u/ml) (1 mkl (1u)).

Смесь инкубировали при 37 °С в течение 30 минут. Для остановки реакции в смесь добавляли по 1 мкл 25 mM EDTA и инкубировали при 65 °С в течение 10 минут.

Полученный раствор РНК осаждали этанолом для последующей очистки экзонуклеазой (S1 или Lambda) и/или осаждали в присутствии 2М хлорида лития.

2. Протокол для приготовления РНК, свободной от ДНК, с помощью экзонуклеазы S1

Осадок РНК растворяли с одновременной обработкой экзонуклеазой S1 (#EN0321, Fermentas): 5х буфер (10мкл), S1 экзонуклеаза (1мкл), вода (40мкл). Инкубировали смесь при комнатной температуре 30 мин.

Инактивировали ферментную активность после добавления 2мкл 0,5М ЭДТА нагреванием при 70 ⁰С в течение 10 мин.

3. Протокол для приготовления РНК, свободной от ДНК, с помощью экзонуклеазы Lambda

Осадок РНК растворили с одновременной обработкой экзонуклеазой Lambda (#EN0561, Fermentas): 10х буфер (5мкл), Lambda экзонуклеаза (1мкл), вода (45 мкл). Инкубировали смесь при 370С - 30 мин.

Инактивировали ферментную активность после добавления 2мкл 0,5М ЭДТА нагреванием при 80 ⁰С в течение 10 мин.

4. Протокол осаждения РНК с помощью хлорида лития

После нуклеазной обработки к раствору РНК добавляли ¼ объема 10М LiCl и инкубировали при 6 0С в течение 30 мин., затем в течение 15мин при -20 °С.

Смесь центрифугировали 15 мин при 13000 об/мин. Супернатант отобрали, оставив некоторый объем на дне, т.к. осадок не визуализируется.

Осадок промывали 200 мкл холодного 2,5 М LiCl. Повторяли центрифугирование. Полученный осадок дважды отмывали 80% этанолом.

Осадок РНК подсушили от остатков спирта при +40 0С в течение 25 мин, затем растворяли в DEPC-H₂O при +37 ⁰С в течение 5 мин.

2.5. Синтез кДНК на базе матрицы РНК

Для получения кДНК на матрице выделенной РНК (не более 1 мкг) проводили реакцию обратной транскрипции, используя рэндом гексамерные праймеры.

РНК, в количестве не более 1 мкг, растворяли в объеме 10 мкл DEPC-H2O, смешивали с 1 мкл Rand-oligo и 1 мкл (10-15 пикомоль) специфического праймера. Прогревали смесь при 70 °С 5 мин и охлаждали при 10 °С в течение 5 мин.

Приготовили реакционную смесь на необходимое количество реакций: в одноразовой стерильной пробирке, используя одноразовые стерильные наконечники с барьером, смешали 5-х ОТ-буфер, 5-х dNTP-mix, DEPC-H2O и ревертазу, согласно прописи в таблице:

Количество реакций	5-х ОТ-буфер, мкл	5-х dNTP-mix, мкл	DEPC-H2O, мкл	М-MLV ревертаза, мкл
1	4	4	1,5	0,5
3	12	12	4,5	1,5
6	24	24	9,0	3,0
9	36	36	13,5	4,5
12	48	48	18,0	6,0

Используя наконечник с барьером, добавляли 10 мкл готовой реакционной смеси в пробирку с РНК, осторожно перемешивали пипетированием. Экспонировали пробирки при 37 °С в течение 30 мин.

Для прекращения реакции обратной транскрипции смесь прогревали при 70 ⁰С в течение 10мин.

2.6. Проведение бисульфитной модификации проб ДНК набором Imprint™ DNA Modification Kit (Sigma)

Предварительно подготовили реактивы:

Этанол-содержащий очищающий раствор – добавили 8,2 мл абсолютного раствора в бутылку и mix.

90% - ый раствор этанола – добавили 500 мкл воды к 4,5 мл абсолютного этанола.

Буфер / Этанол промывочный раствор – добавили к 10 мкл Balance буфера 1,1 мл 90% - ого этанола.

Для проведения модификации воспользовались двушаговой процедурой:

Поместили образец ДНК в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл и довели полный объем до 24 мкл 0,5 мг/мл водным раствором BSA. Добавили 1 мкл Balance буфера. Перемешали и оставили образец при 37 °С на 10 мин.

Добавили 1,1 мл раствора для модификации ДНК в пузырек 1 с реагентом модификации ДНК. Перемешивали содержимое пузырька до тех пор, пока раствор не стал прозрачным. Добавили 40 мкл буфера и перемешали.

Добавили 125 мкл готового раствора из пузырька 2 в образец ДНК после первого шага инкубации. Перемешали и оставили при 65 °С в течение 90 мин.

Провели пост-модификационную очистку ДНК:

Поместили колонку в 2 мл пробирку Capless Collektion, предназначенную для каждого модифицированного образца.

Добавили 300 мкл промывочного Capture раствора для колонки и оставили на 1 мин.

Добавили раствор с модифицированной ДНК из пузырька 3 на колонку, уже содержащую промывочный Capture раствор. Центрифугировали колонку при 12000 об/мин в течение 20 секунд. Слили отцентрифугированную жидкость.

Добавили 200 мкл этанол-содержащего раствора на колонку и повторили центрифугирование в течение 20 секунд. Добавили 50 мкл буфера/этанола на колонку. Проследили, чтобы воздушные пузырьки не препятствовали продвижению жидкости на фильтр колонки. Оставили при комнатной температуре на 8 минут. После инкубации центрифугировали в течение 20 секунд. Отцентрифугированную жидкость слили.

Добавили 200 мкл 90% - ого этанола на колонку, центрифугировали в течение 20 секунд. Жидкость слили.

Добавили 200 мкл 90% - ого этанола на колонку и центрифугировали в течение 40 секунд. Пробирку на 2 мл отбросили и поместили колонку в пробирку на 1,5 мл.

Добавили 8-20 мкл буфера для промывания колонки. Оставили на 1 минуту и затем центрифугировали в течение 20 секунд. Колонку удалили.

Элюированный раствор, содержащий модифицированную ДНК, использовали для ПЦР.

2.7. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ПЦР в реальном времени

Для приготовления реакционной ПЦР смеси использовали набор реактивов для ПЦР-РВ SYBR Green I (ООО «Синтол») или набор реактивов для ПЦР того же производителя.

В микроцентрифужной пробирке готовили mix-смесь из расчёта 25 мкл на одну реакцию амплификации, содержащую: 1-кратный буферный раствор; по 0,2 мМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (дАТФ, дТТФ, дЦТФ, дГТФ); по 12 - 50 пМ каждого праймера; 1ак.ед. Таq-полимеразы (ООО «Синтол»). Общий объем реакционной смеси доводили бидистиллированной водой. В каждую 0,5мл пробирку добавляли mix-смесь и 2-10 нг образца ДНК или кДНК.

В одну из пробирок (отрицательный контроль) вместо образца ДНК вносили 2 мкл бидистиллированной воды.

Пробирки помещали в термоциклер iCycler iQ 4 (BioRad) и проводили реакцию амплификации по следующему температурному режиму:

1 этап. Денатурация ДНК: 94 °С - 5 мин.

2 этап. 35-40 циклов: денатурации ДНК (94 °С - 1 мин), отжиг праймеров (45 - 68 °С – 30с), синтез комплементарной цепи (72 °С - 1 мин).

3 этап. Досинтез комплементарной цепи 72 °С - 10 мин.

Результаты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле.

Результаты ПЦР-РВ анализировали с помощью программного обеспечения iCycler iQ 4 (BioRad). Количественную оценку уровня экспрессии генов давали по методу ∆Ct Livak с использованием референтного гена.

2.8. Проведение электрофореза ДНК в агарозном геле 2.8.1. Подготовка к электрофорезу в агарозном геле

Приготовление буферного раствора для электрофореза (ТВЕ). В мерном цилиндре смешивали: трис - 4,84 г, ледяную уксусную кислоту - 1,2 мл, ЭДТА из раствора 0,5 М - 100 мл, общий объем доводили дистиллированной водой до 1 л. Бромистый этидий добавляли до конечной концентрации 0,5 мкг/мл.

Приготовление 2% агарозного геля. К 2,0 г агарозы добавляли 100 мл буферного раствора для электрофореза. Смесь в термостойкой колбе нагревали в микроволновой печи до расплавления агарозы, после охлаждения агарозы до температуры 50 °С добавляли этидиум бромид (10 мкг/мл), перемешивали и выливали на подготовленный столик аппарата для электрофореза (типа ПГ-9), при этом образовался слой агарозы высотой 4 мм. С помощью специального штампа - "гребенки" на катодном конце геля формировали лунки для нанесения проб.

Буферные емкости аппарата ПГ-9 заполняли ТВЕ так, чтобы он покрыл гель слоем 4 - 5 мм.

2.8.2. Проведение электрофореза

5 мкл ПЦР-пробы смешивали с 1 мкл 6х буфера (Fermentas). Смеси вносили в лунки геля под буферный раствор для электрофореза с помощью микродозатора.

Электрофорез проводили при градиенте напряжения 10 В/см² в течение 45 - 90 мин, пока краситель - бромфеноловый синий - не пройдет от катодного конца геля 6 - 8 см (для разделения фрагментов ДНК, отличающихся на 20 - 50 bp, - 10 - 20 см).

Окрашенную бромистым этидием ДНК в геле просматривали под ультрафиолетовым излучением, для чего использовали трансиллюминатор с максимальной длиной волны 254 нм. Гель фотографировали в проходящем ультрафиолете с помощью гель-документирующей системы GelDoc XR (Bio-Rad).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Выделение ДНК из цельной крови и препаратов плазмы крови

Для сопоставления эффективности способов выделения ДНК использовали для экстракции два метода: ДНК из плазмы выделяли методом «на стекле», ДНК из цельной крови - фенол-хлороформным методом.

Таблица 1

Концентрация ДНК, экстрагированной из цельной крови и плазмы

Цельная кровь		Плазма крови
Пробы	Концентрация ДНК, нг/мкл	Пробы	Концентрация ДНК, нг/мкл
24g	11.1	3	0,049
50c	17.6	10	0,028
51c	4.4	14	0,05
52c	12.7	35	0,031
54pr	5.8	42	0,029
89c	1.3	50	0,08
91	3.1
Vod	11.1

Согласно данным, представленным в таблице 1, количественный выход ДНК при выделении из цельной крови фенол-хлороформным методом существенно превосходит количественный выход при выделении ДНК «на стекле» из плазмы крови (проба 50).

Максимальная концентрация ДНК при выделении из цельной крови соответствует пробам 24g и Vod (11,1нг/мкл), минимальная – пробе 89c (1,3 нг/мкл). При выделении ДНК из плазмы максимальная концентрация наблюдается в пробе 50 (0,08 нг/мкл), минимальная - в пробе 10 (0,028 нг/мкл).

Если сравнивать средние показатели концентраций ДНК при выделении из цельной крови (8,388 нг/мкл) и из плазмы крови (0,045 нг/мкл), видно, что разница между этими величинами колоссальна: средний результат концентрации ДНК в цельной крови превышает средний показатель концентрации ДНК в плазме в 186,4 раза.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

1000 bp

100 bp

Рис.1 Электрофореграмма тотальной ДНК, выделенной из цельной крови (№8-16) и плазмы (№1-6). На дорожке №9 нанесен маркер молекулярной массы ДНК 100 bp (Fermentas)

На рисунке 1 изображена электрофореграмма ДНК, полученной из цельной крови и плазмы крови, которая наглядно демонстрирует, что концентрация ДНК, выделенной из плазмы, настолько мала, что ее невозможно визуализировать. Фрагменты ДНК, выделенной из цельной крови, просматриваются на электрофореграмме в виде ясно идентифицируемых полос особенно на дорожках 13, 15 и 16. Эти фрагменты отличаются высокой интенсивностью по сравнению с фрагментами ДНК, выделенными из плазмы, и соответствуют размеру более 1000 bp, что свидетельствует о том, что из цельной крови была экстрагирована высокомолекулярная ДНК.

Т.о., для дальнейших молекулярно-генетических исследований наиболее предпочтительно выделение ДНК методом фенол-хлороформной экстракции. Данный метод дал лучший выход материала: полученные пробы представлены высокомолекулярной фракцией ДНК.

3.2. Постановка опыта по определению метилирования ДНК с помощью набора Imprint DNA Modification Kit

Пробы ДНК: 8 проб (№ 24hg, 50c, 51c, 52c, 54pr, 57hg, 89c, 91c) выделено из крови с консервантом, хранившейся при -80⁰С, № 50s - из плазмы крови также замороженной, Vod – из свежей крови донора Водолажского Д.И.

Таблица 2

Концентрация ДНК в пробах

Пробы	Концентрация ДНК, нг/мкл
24g	11.1
50c	17.6
51c	4.4
52c	12.7
54pr	5.8
89c	1.3
91	3.1
Vod	11.1
50s	0.04

Постановка ПЦР для секвенирования с праймерами

F15989- R00274, F15971- R16410, F00015 - R00389 на 10 пробах ДНК после обработки бисульфитом и на 10 пробах нативной ДНК

Таблица 3

Mix-смесь для ПЦР

	Наименование	Кон-ция	Объём на 1 р-цию	Объём на 20+1+1=22 р-ций
1	Вода		31,1	684,2
2	10х ПЦР буфер с MgCl2		6	132
3	дНТФ 2,5мМ	0,25	4,8	105,6
4	MgCl225 мМ	2,5	4,8	105,6
5	Смесь праймеров		2,4	52,8
6			2,4	52,8
7	HotTaq 5 ед/мкл	1 ед	0,5	11
8	кДНК (66мкл)	2нг	8	0
			60	1144

Таблица 4

Расположение проб на стрипах

№ стрипа	1	2	3	4	5	6	7	8
1 F15989- R00274	24hg	50c	51c	52c	54pr	57hg	89c	91c
2 F15971- R16410	24hg	50c	51c	52c	54pr	57hg	89c	91c
3 F00015 - R00389	24hg	50c	51c	52c	54pr	57hg	89c	91c
4 F15989- R00274	24hg_m	50c_m	51c_m	52c_m	54pr_m	57hg_m	89c_m	91c_m
5 F15971- R16410	24hg_m	50c_m	51c_m	52c_m	54pr_m	57hg_m	89c_m	91c_m
6 F00015 - R00389	24hg_m	50c_m	51c_m	52c_m	54pr_m	57hg_m	89c_m	91c_m
7	V_ F15989- R00274	V_ F15971- R16410	V_ F00015 - R00389	V_m F15989- R00274	V_m F15971- R16410	V_m F00015 - R00389	K_ F15989- R00274	K_ F15971- R16410
8	50s_ F15989- R00274	50s_ F15971- R16410	50s_ F00015 - R00389	50s_m F15989- R00274	50s_m F15971- R16410	50s_m F00015 - R00389	K_F00015 - R00389

Постановка ПЦР для секвенирования с праймерами

F15971- R00389, F15989- R00274

Таблица 5

Mix-смесь для постановки ПЦР

	Наименование	Кон-ция	Объём на 1 р-цию	Объём на 4+1=5 р-ций
1	Вода		31,1	155,5
2	10х ПЦР буфер с MgCl2		6	30
3	дНТФ 2,5мМ	0,25	4,8	24
4	MgCl225 мМ	2,5	4,8	24
5	Смесь праймеров		2,4	12
6			2,4	12
7	HotTaq 5 ед/мкл	1 ед	0,5	2,5
8	кДНК (66мкл)	2нг	8	40
			60	300

Очистка проб на колонках для секвенирующей амплификации

Таблица 6

Расположение проб на колонках Invitek

50-HV1-F	50-HV1_m-F	V_HV1_F	V_HV1_m_F	50-HV2-F	50-HV2_m-F	V_HV2_F	V_HV2_m_F
50-HV1-R	50-HV1_m-R	V_HV1_R	V_HV1_m_R	50-HV2-R	50-HV2_m-R	V_HV2_R	V_HV2_m_R

В результате постановки опыта была отработана методика постановки ПЦР, а так же методика по определению метилирования ДНК с помощью обработки проб бисульфитом.

3.3. Определение генной экспрессии в лейкоцитах переферической крови

РНК выделяли из лейкоцитов периферической крови пробы №7к. Препараты РНК доочищали от остатков ДНК. Синтезировали на матрице РНК с помощью реакции обратной транскрипции кДНК и ставили ПЦР-РВ. Процесс подготовки микс-смеси и порядок нанесения образцов на плашку отражены в таблицах 7 и 8.

Таблица 7

Рецептура микс-смеси для ПЦР-РВ

	Наименование	Кон-ция	Объём на 1 р-цию	Объём на 6+1+1= 8 р-ций	Объём на 12+1+1=14 р-ций (Hv2, Gstp, Actb)	3 повтора
1	Вода			106,4	186,2	69
2	10х ПЦР буфер Б		2,5	20	35	0
3	дНТФ 2,5мМ	0,25	2,5	20	35	0
4	MgCl225 мМ	2,5	2,5	20	35	0
5	Смесь праймеров		1	8	14	0
6			1	8	14	0
7	HotTaq 5 ед/мкл	1 ед	0,2	1,6	2,8	0
8	кДНК (66мкл)	2нг	2	0	0	6
			25	184	322	75

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

VegfA_cDNA_17к

VegfB_cDNA_7к

Hv2_cDNA_7к

Bcl2_cDNA_7к

Bax_cDNA_7к

P53_cDNA_7к

Gstp_cDNA_7к

Tert_cDNA_7к

Malat_cDNA_7к

Tnf_cDNA_7к

Actb_cDNA_7к

Actb_7к

VegfA_cDNA_17к

VegfB_cDNA_7к

Hv2_cDNA_7к

Bcl2_cDNA_7к

Bax_cDNA_7к

P53_cDNA_7к

Gstp_cDNA_7к

Tert_cDNA_7к

Malat_cDNA_7к

Tnf_cDNA_7к

Actb_cDNA_7к

Actb_7к

C

VegfA_cDNA_17к

VegfB_cDNA_7к

Hv2_cDNA_7к

Bcl2_cDNA_7к

Bax_cDNA_7к

P53_cDNA_7к

Gstp_cDNA_7к

Tert_cDNA_7к

Malat_cDNA_7к

Tnf_cDNA_7к

Actb_cDNA_7к

Actb_7к

D

Hv2_7к

Hv2_7к

Hv2_7к

Gstp _7к

Gstp _7к

Gstp _7к

E

VegfA_k

VegfB_k

Hv2_k

Bcl2_k

Bax_k

P53_k

Gstp_k

Tert_к

Malat_k

Tnf_к

Actb_к

F

G

H

Таблица 9

Уровень экспрессии ряда генов

	7к
Наименование генов	Ct_средняя	ΔCt	Control
VEGFA	27,93	0,0002226	35,4
VEGFB	26,47	0,0006152	N/A
HV2	20,37	0,0421984	31,9
BCL2	23,77	0,0039976	37
BAX_	24,43	0,0025183	N/A
p53_	27,73	0,0002557	N/A
GSTP	23,93	0,0035614	28,7
Tert	33,60	0,0000044	35,5
Malat	24,00	0,0034006	N/A
Tnf	26,33	0,0006748	N/A
ACTB_cDNA	15,80		36,2
ACTB	34,10	18,30

Уровень экспрессии исследованных генов отражен в значении Ct (средняя по 3 повторам), означающий номер цикла амплификации, на котором начинается флюоресценция ПЦР-продукта. Конечная оценка экспрессии дана по методу ∆Ct Livak относительно уровня экспрессии референтного гена (ACTB – ген -актина).

Т.о. постановка опыта по выделению РНК, доочистка препарата РНК от остаточной ДНК, синтез кДНК в реакции обратной транскрипции позволили нам успешно провести ПЦР-РВ и вычислить уровень экспрессии ряда генов.

ВЫВОДЫ

1. Благодаря изучению специальной литературы были охарактеризованы некоторые генетические маркеры рака предстательной железы и рассмотрены их положительные и отрицательные стороны при использовании для диагностики данного заболевания. Было выяснено влияние эпигенетических изменений, в частности, метилирования ДНК, на развитие рака предстательной железы.

2. В результате отработки методик экстрагирования ДНК и РНК было выявлено, что для дальнейших молекулярно-генетических исследований наиболее предпочтительно выделение ДНК и РНК фенол-хлороформной экстракцией, т. к. этот метод оказался наиболее продуктивным. В ходе эксперимента были отработаны методики постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Постановка опыта по выделению РНК, доочистка препарата РНК от остаточной ДНК, синтез кДНК (комплиментарной ДНК) в реакции обратной транскрипции позволили успешно провести ПЦР-РВ и вычислить уровень экспрессии ряда генов.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Ahlegren G., Pedersen K., Lundberg S. et al. Neuroendocrine differentiation is not prognostic of failure after radical prostatectomy but correlates with tumor volume. //Urology. 2000. V. 56. P. 1011-1015.

2. Berruti A., Dogliotti L., Mosca A. et al. Potential clinical value of circulating chromogranin A in patients with prostate carcinoma. //Ann. Oncol. 2001. V. 12. P. 153-157.

3. Bestor Т.Н., Tycko B. Creation of genomic methylation patterns // Nat. Genet. 1996. Vol. 12. P. 363-367.

4. Brothman A. Cytogenetics and molecular genetics of cancer of the prostate // Am. J. Med. Genet. 2002. V. 115. P. 150-156.

5. Chieco P., Bertaccini A., Giovannini C., Stecca B.A., Martorana G. Telomerase activity in touch-imprint cell preparations from fresh prostate needle biopsy specimens.//Eur. Urol. 2001. V. 40. P. 666-672.

6. Christiansen J.J., Rajasekaran S.A., Moy P. et al. Polarity of prostate specific membrane antigen, prostate stem cell antigen, and prostate specific antigen in prostate tissue and in a cultured epithelial cell line. //Prostate. 2003. V. 55. P. 9-19.

7. Coffey D.S. Prostate cancer. An overview of an increasing dilemma // Cancer. 1993. V. 71 (Suppl 3). P. 880–886.

8. Dawson N.A., Vogelzang N.J.Prostate cancer// Wiley-Liss, Inc. New York. 1994.

9. Epstein J.I., Carmichael M.J., Pizov G. et al. Influence of capsular penetration on progression following radical prostatectomy: A study of 196 cases with long-term followup // J. Urol. 1993. V. 150/ P. 135–141.

10. Gu Z., Thomas G., Yamashiro J. et al. Prostate stem cell antigen (PSCA) expression increases with high Gleason score, advanced stage and bone metastasis in prostate cancer. //Oncogene. 2000. V.19. P. 1288-1296.

11. Isshiki S., Akakura K., Komiya A. et al. Chromogranin a concentration as a serum marker to predict prognosis after endocrine therapy for prostate cancer.// J. Urol. 2002. V. 167. P. 512-515.

12. JablonkaE., Lamb M.J. Epigenetic inheritance in evolution //J.Evol. Biol. 1998. Vol. 11.P. 159-183.

13. Jemal A., Murray Т., Ward E. et al. Cancer statistics//CA Cancer J. Clin. 2005. V.55. N 1. P. 10-30.

14. Jeronimo C., Usadel H., Henrique R. et al. Quantitation of GSTP1 methylation in non-neoplastic prostatic tissue and organ-confined prostate adenocarcinoma. //J. Natl. Cancer Institute (Bethesda). 2001. V. 93. P. 1747-1752.

15. Lengauer C., Kinzler K.W., Vogelstein B. Genetic instabilities in human cancers // Nature. 1998. V. 396. P. 643-649.

16. Liguo Zhang Ph.D., Chun-Yu Wang Ph.D., Rui Yang Ph.D. et al. Real-time quantitative RT-PCR assay of prostate-specific antigen and prostate-specific membrane antigen in peripheral blood for detection of prostate cancer micrometastasis // Urol.Oncol.: Seminars and Original Investigations. 2007.

17. Lilleby W., Paus E., Skovlund E., Fossa S.D. Prognostic value of neuroendocrine serum markers and PSA in irradiated patients with pN0 localized prostate cancer. //Prostate. 2001. V. 46. P.126-133.

18. Lin X., Asgari K., Putzi M.J. et al. Reversal of GSTP1 CpG island hypermethylation and reactivation of pi-class glutathione S-transferase (GSTP1) expression in human prostate cancer cells by treatment with procainamide. //Cancer Res. 2001. V.61. P.8611-8616.

19. Maruyama R., Toyooka S., Toyooka K.O. et al. Aberrant promoter methylation profile of prostate cancers and its relationship to clinicopathological features. //Clinical. Cancer Res. 2002. V.8. P.514-519.

20. Meid F.H., Gygi C.M., Leisinger H.J., Bosman F.T., Benhattar J. The use of telomerase activity for the detection of prostatic cancer cells after prostatic massage.//J.Urol. 2001. V.65. P.1802-1805.

21. Rhodes D.R., Sanda M.G., Otte A.P., Chinnaiyan A.M., Rubin M.A. Multiplex biomarker approach for determining risk of prostate-specific antigen-defined recurrence of prostate cancer. // J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda). 2003. V. 95. P. 661-668.

22. Riegman P.H., Vlietstra R.J., Klaassen P. et al. The prostate-specific antigen gene and the human glandular kallikrein-1 gene are tandemly located on chromosome 19 // FEBS Lett. 1989. V.247. P. 123-126.

23. Ross S., Spencer S.D., Holcomb I. et al. Prostate stem cell antigen as therapy target: tissue expression and in vivo efficacy of an immunoconjugate. //Cancer Res. 2002. V. 62. P. 2546-2553.

24. Sharief F.S., Li S.S.-L. Structure of human prostatic acid phosphatase gene // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. V. 184. P. 1468-1476.

25. Straub B., Muller M., Krause H. et al. Molecular staging of surgical margins after radical prostatectomy by detection of telomerase activity. //Prostate. 2001. V. 49. P. 140-144.

26. Yoder J.A., Walsh C.P., Bestor Т.Н. Cytosine methylation and the ecology of intragenic parasites //Trends Genet. 1997. Vol. 13. P. 335-340.

27. Zheng S.L., Augustsson-Balter K., Chang В. et al. Sequence variants of toll-like receptor 4 are associated with prostate cancer risk: results from the CAncer Prostate in Sweden Study // Cancer Res. 2004. V. 64. N 8. P. 2918-2922.

28. http://translate.google.ru

29. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17485372

30. http://www.medscape.com/viewarticle/703576

Код для цитирования: Скопировать